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文檔簡介
1、本研究旨在為組織工程治療神經(jīng)損傷、疾病探索新的治療策略——自聚合納米纖維材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold,SAPNS)介導(dǎo)RNA干擾(RNA interference,RNAi)RhoA表達促進脊髓損傷的修復(fù)。
目前治療脊髓損傷的方法很多,外周神經(jīng)移植、細胞移植、生物材料填充損傷腔以及消除抑制因子等。這些研究在一定程度上都促進了脊髓損傷的修復(fù)。然而,外周神經(jīng)移植需要
2、考慮神經(jīng)來源、細胞移植也有其來源及倫理道德方面的局限、消除抑制因子不徹底、以及治療策略的單一性、難以針對脊髓損傷修復(fù)困難的諸多不利因素等,都成為脊髓損傷修復(fù)的瓶頸。
因此,尋求新型生物材料和探索新的方法避免以上問題,從而為臨床運用提供更具可行性的策略,成為脊髓損傷修復(fù)的研究熱點。近年來,各種新方法和新型生物材料不斷涌現(xiàn)。
SAPNS是近年來由美國麻省理工學(xué)院Zhang S課題組發(fā)明的一新型納米材料,目前已經(jīng)證
3、明它在多種組織修復(fù)中能發(fā)揮良好的效果,被認為是組織損傷修復(fù)中最具應(yīng)用前景的組織工程修復(fù)材料之一。其在組織損傷修復(fù)的運用中相比其他生物材料具有以下優(yōu)勢:不會引起明顯的免疫排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、其納米纖維直徑非常接近細胞外基質(zhì),能為細胞存活與遷移提供三維環(huán)境,能將攜帶生物致病源和污染的風(fēng)險降到最低,具有極好的組織相容性,無細胞毒性,降低產(chǎn)物可被組織吸收利用。
研究表明RhoA在脊髓損傷修復(fù)中具有重要的作用。RhoA是屬于Rho家
4、族的一種小分子GTPase,它是所有真核細胞細胞骨架肌動蛋白的調(diào)節(jié)因子。RhoA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段對神經(jīng)元遷移和突起的生長發(fā)揮重要作用,但在成年神經(jīng)元中基本不表達。當神經(jīng)元受損后8h,RhoA表達又開始增高,損傷后3d可達到高峰,并可持續(xù)高表達2w以上。RhoA在神經(jīng)元損傷后重新高表達是中樞神經(jīng)再生困難的一個重要因為。
目前已知的抑制神經(jīng)再生的大部分相關(guān)因子都是通過激活下游的RhoA信號通路來發(fā)揮作用的。脊髓損傷后RhoA
5、表達的增高可導(dǎo)致軸突生長錐塌陷以及受損神經(jīng)元凋亡,這些都是導(dǎo)致脊髓損傷后再生困難的主要因為。因此,設(shè)法降低RhoA的表達或抑制其信號通路有可能成為促進脊髓損傷修復(fù)的一個新的治療策略。
RNA干擾是近十幾年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù),它可利用 siRNA,-shRNA或miRNA感染靶細胞以降低特定基因的表達。目前,已有不少關(guān)于導(dǎo)入 siRNA進行體內(nèi)RNA干擾的報道。其中對中樞神經(jīng)組織進行RNA干擾的方法主要有
6、2種:即靜脈注射和局部微量注射。然而靜脈注射用藥量大難以避免全身副作用,局部微量注射可對神經(jīng)組織造成不必要的二次損傷。所以有必要探索更加確實可行的用藥方法。
本研究在脊髓損傷模型的基礎(chǔ)上,在損傷處移植含有 RhoA特異性 siRNA(RhoA—siRNA)和 SAPNS的復(fù)合材料,針對脊髓修復(fù)難點的多種復(fù)雜因素,以期在修復(fù)脊髓損傷處的同時減低RhoA的表達,從而探索促進脊髓損傷后結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)的新方法。
本研
7、究分三個部分。
第一部分:移植材料構(gòu)建以及脊髓損傷模型建立和移植。
昆明小鼠,雌性,65只,12周齡,30-35g;動物分組和每組數(shù):假手術(shù)組(sham)10只,生理鹽水組(saline)15只,SAPNS組17只,siRNA+SAPNS組23只。
無菌下取0.50DRhoA特異性干擾 RNA(RhoA-siRNA)或熒光標記 siRNA(FAM-siRNA),用6μl DEPC水溶解。取2μl
8、siRNA溶液,2μlLipofect2000以及10μlSAPNS,于干凈的培養(yǎng)皿中迅速混合,后置于0.1M PBS溶液中4℃下孵育30min,使材料充分聚合。昆明小鼠麻醉后在小鼠 T7-9位置打開椎板,暴露脊髓,剪開硬脊膜后在T8位置垂直切除長度為1mm的一段脊髓。在形成的損傷腔內(nèi)填充上述構(gòu)建的移植材料或等量的生理鹽水。
第二部分:siRNA轉(zhuǎn)染效率和RhoA表達的檢測。
siRNA轉(zhuǎn)染效率檢測:移植入
9、FAM-siRNA+SAPNS的小鼠在手術(shù)后2d,1w,2w取材,取材部位脊懿為 T6-11,腦為皮質(zhì)運動區(qū)。后做冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察并拍照,記錄siRNA進入脊髓和大腦皮質(zhì)運動區(qū)神經(jīng)元的情況。結(jié)果顯示,siRNA被脊髓神經(jīng)元軸突攝取,并且順利進入大腦運動皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞體。
RhoA表達的檢測:手術(shù)后1w各組任取5只小鼠,取材切片。行RhoA免疫組織化學(xué)染色,檢測RhoA表達。在熒光顯微鏡下觀察損傷區(qū)及其附近神經(jīng)元
10、內(nèi)RhoA表達情況,并拍照記錄。結(jié)果顯示,在RhoA-siRNA+SAPNS組中,RhoA表達顯著降低。
第三部分:脊髓修復(fù)效果評定,行為學(xué)檢測和軸突再生定量分析。
對實驗所得計量資料軸突密度數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析(One-Way ANOVA)后用 LSD法作兩兩之間比較;BMS評分值用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗法多組間比較,組間兩兩比較用 Mann-Whitney
11、U檢驗。
后肢功能評定:手術(shù)后10w對所有剩下小鼠進行后肢運動功能BMS評定。軟件結(jié)果顯示,RhoA-siRNA+SAPNS組小鼠功能恢復(fù)好于損傷組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
軸突再生定量分析:術(shù)后10w取材切片,行軸突特異性標志蛋白NF200免疫組織化學(xué)染色,拍照,每只動物記錄5張切片,使用圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus;Media Cybernetics,Silver Spring,Marylan
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