溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3蛋白功能初探.pdf

1、目的：預(yù)測(cè)溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3(Eh14-3-3)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，克隆與鑒定溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3基因，并純化重組Eh14-3-3蛋白，分析純化產(chǎn)物的免疫學(xué)特性，制備抗重組Eh14-3-3蛋白血清，比較不同內(nèi)阿米巴屬蟲株14-3-3蛋白序列，探討14-3-3蛋白作為研究遺傳進(jìn)化標(biāo)記分子的可能性。
　　 方法：利用生物信息學(xué)網(wǎng)站的各種在線工具和Vector NTI Suite軟件包對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴14-3-3(Eh14

2、-3-3)基因進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)，分別以溶組織內(nèi)阿米巴HM1：IMSS株滋養(yǎng)體總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA鏈和基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增Eh14-3-3蛋白編碼基因序列，克隆入pET19b載體，并用雙酶切法和DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，用樹脂層析純化目的蛋白。SDS-PAGE鑒定，并用ELISA鑒定純化產(chǎn)物的免疫學(xué)特性，檢測(cè)病人和正常人血清對(duì)其的反應(yīng)性，繼而以之免疫小鼠制備抗血清。隨后分

3、別擴(kuò)增各不同內(nèi)阿米巴蟲株滋養(yǎng)體的14-3-3蛋白編碼基因序列，并對(duì)它們進(jìn)行了比較分析。
　　 結(jié)果：溶組織內(nèi)阿米巴具有三種Eh14-3-3蛋白編碼基因的異構(gòu)體，與GenBank收錄(編號(hào)分別為EHU13418，EHU13419，EHU13420)的Eh14-3-3蛋白編碼基因一致。重組Eh14-3-3蛋白，通過(guò)純化層析，30kD附近得到單一蛋白條帶。ELISA等實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化得到的Eh14-3-3蛋白與慢性反復(fù)發(fā)作者血清和阿米巴結(jié)

4、腸炎病人血清有反應(yīng)，與包囊攜帶者血清、急性阿米巴肝膿瘍患者血清和正常人血清無(wú)明顯反應(yīng)?？怪亟MEh14-3-3蛋白血清的與溶組織內(nèi)阿米巴粗抗原ELISA反應(yīng)的效價(jià)為1:200，但隨后的細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)為陰性。不同內(nèi)阿米巴屬蟲株的14-3-3蛋白序列比較結(jié)果提示內(nèi)阿米巴屬14-3-3基因高度保守，生物信息學(xué)分析還提示該蛋白是研究物種進(jìn)化的理想分子。
　　 結(jié)論：溶組織內(nèi)阿米巴含有三個(gè)14-3-3蛋白的異構(gòu)體，它們可能在溶組織內(nèi)阿米巴的成