環(huán)境雌激素壬基酚對仔鼠神經(jīng)發(fā)育毒性及機制研究.pdf

1、壬基酚(Nonylphenol，NP)是環(huán)境雌激素樣化學物的典型代表，作為乳化劑廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、日用品生產(chǎn)中，可由污水排入水體環(huán)境。NP在環(huán)境中難于降解，具有高度脂溶性和生物蓄積性，可經(jīng)口腔、呼吸道、皮膚等多種途徑進入機體，對人群健康產(chǎn)生危害。
　　研究估計，非職業(yè)暴露人群通過各種途徑接受NP的暴露水平為3.6～31.4μg/kg/day。體內、外實驗顯示NP的雌激素活性約為雌二醇的10-4～10-5倍，可模擬雌激素與機體內

2、多組織器官的雌激素受體結合發(fā)揮雌激素樣作用，目前較多關于NP生殖和發(fā)育毒性的研究表明，NP的毒性機制主要源于其對內分泌的干擾作用，可對魚類、兩棲動物及哺乳動物多種器官產(chǎn)生不良作用：包括影響生殖、內分泌、免疫、消化、泌尿等系統(tǒng)的功能，然而NP對子代神經(jīng)行為發(fā)育的影響目前尚不清楚。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育時期對體內多種激索水平的變化非常敏感，相對成人而言，胎兒在胚胎中后期和哺乳期，血腦屏障未發(fā)育成熟，中樞神經(jīng)系統(tǒng)正值器官形成期，此時期

3、最易受外來毒物損害，其神經(jīng)系統(tǒng)器官發(fā)育和功能很可能受到影響。因此，若機體此期間若暴露于內分泌干擾物NP，可能導致胎兒神經(jīng)系統(tǒng)所受的損害會比其它時期更為嚴重。以往研究大多是多種環(huán)境內分泌干擾物(EnvironmentalEndocrine Disrupters，EEDs)的聯(lián)合暴露，不能說明NP單獨的毒性作用，得出的結果也各不相同，因此結論尚具有不確定性，對機理的研究較片面，缺乏深入而系統(tǒng)的研究。
　　本課題以大鼠為研究對象，首次在

4、神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育敏感期暴露NP，觀察NP對仔鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響，測試其學習記憶能力的變化，并從細胞凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質細胞纖維酸性蛋白、信號傳遞等角度進行研究，同時利用基因芯片從分子水平嘗試探討NP神經(jīng)毒性的分子機制，進而可為NP在發(fā)育期間暴露的危害評價提供實驗數(shù)據(jù)，為制定相關環(huán)境污染標準提供理論依據(jù)。
　　第一部分，NP對母鼠生殖和仔鼠生長發(fā)育的影響
　　目的：研究NP對雌性大鼠生產(chǎn)和仔鼠生長發(fā)育的影響。
　　

5、方法：SD孕鼠28只隨機分為4組(對照組、50mg/kg NP、100mg/kgNP、200mg/kg NP)，每組6～7只，妊娠第9～15天灌胃NP，觀察孕鼠的體重、進食、染毒后的一般情況以及生殖情況，觀察仔鼠的出生指標及體重變化，檢測仔鼠早期生理發(fā)育指標。
　　結果：(1)各實驗組孕鼠末見明顯中毒癥狀，100mg/kg(中劑量組)和200mg/kg(高劑量組)NP組孕鼠每窩平均胎數(shù)、活胎數(shù)降低，死胎數(shù)增加，p<0.05。(2)

6、高劑量組仔鼠身長、尾長、肛殖距縮短，p<0.05。(3)各實驗組仔鼠出生臟器重量(腦，肝、腎、心等)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，p>0.05。(4)高劑量組體重出生后1、7、14、21、28天均低于對照組，p<0.01。(5)高劑量組仔鼠早期生理發(fā)育指標(張耳、開眼、長毛、出牙)發(fā)育時間較對照組延長，p<0.05。以上指標低劑量組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，p>0.05。
　　結論：在本實驗的染毒方式、時間和劑量下，高劑量組

7、NP對雌鼠的生殖能力有影響，同時可影響仔鼠的出生指標和生長發(fā)育指標。
　　第二部分，NP對仔鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響
　　目的：探討母鼠NP孕期暴露致子代神經(jīng)行為發(fā)育及學習記憶的影響。
　　方法：孕鼠染毒及分組方法同第一部分。在出生后特定的時間，觀察仔鼠斷崖回避、平面翻正、前肢懸掛、空中翻正、聽覺驚愕和視覺定位等早期神經(jīng)行為發(fā)育指標，選擇8周齡仔鼠進行Morris水迷宮和跳臺試驗，檢測NP對其學習記憶的影響；脫椎取腦組織做

8、石蠟切片HE染色光鏡下觀察其病理變化；海馬組織透射電鏡觀察超微結構變化。
　　結果：(1)早期神經(jīng)行為發(fā)育指標：高劑量組仔鼠(斷崖回避、平面翻正、前肢懸掛、空中翻正、聽覺驚愕和視覺定位等)時間較對照組延長(p<0.05)；(2)Morris水迷宮試驗：高劑量組仔鼠水迷宮中逃避潛伏期延長(p<005)；(3)跳臺試驗：反應時間延長，步下潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加(p<005)；(4)病理：HE染色，光鏡可見高暴露組海馬組織充血水腫；(

9、5)透射電鏡：高劑量組仔鼠海馬組織電鏡下見線粒體腫脹呈空泡樣變，染色質濃縮成塊狀聚集在核周圍。
　　結論：NP孕期暴露可阻礙仔鼠早期神經(jīng)行為的發(fā)育，使空間學習記憶能力下降。
　　第三部分，NP對斷乳期仔鼠海馬基因表達譜的影響
　　目的：應用基因芯片技術，考察NP暴露組和對照組仔鼠海馬組織差異基因的表達狀況，篩選部分與神經(jīng)毒性相關的差異表達基因及通路進行進一步機制研究。
　　方法：建立孕期和哺乳期暴露NP的仔鼠模型

10、，提取暴露組和對照組出生1天仔鼠海馬組織mRNA，采用Roche Nimblegen公司生產(chǎn)的12×135位點的包含大鼠26，419個基因的表達譜基因芯片，檢測腦基因的表達，掃描儀進行掃描及處理數(shù)據(jù)。
　　結果：暴露組與對照組共有1，254個差異表達基因，其中619個基因上調，635個基因下調。部分與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關差異表達基因為：A.神經(jīng)營養(yǎng)相關的基因表達：甘丙肽(Galanin，Gal)基因下調，神經(jīng)生長因子(Nerve Gr

11、owth Factor，NGF)基因下調；B.細胞凋亡的相關基因的表達：凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic Protease Activating Factor-1，Apaf-1)基因上調，凋亡抑制基因-1(Defender Against Apoptotic Death-1，DAD1)基因下調，半胱氨酸蛋白酶7(Cysteine-aspartic Acid Protease，Caspase7)基因上調；C.信號傳遞及離子通道相

12、關基因的表達：谷氨酸鹽受體(Glutamate Receptor，Ionotropic，AMPA2)基因下調，鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent Protein KinaseⅡ Delta，Camk2d)基因下調。
　　結論：芯片結果提示：NP能導致仔鼠海馬神經(jīng)元信號傳導、免疫應答、細胞凋亡、炎癥反應因子、神經(jīng)膠質細胞發(fā)育等相關基因的差異表達，以上改變有可能干擾神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能的發(fā)

13、揮。
　　第四部分，NP暴露對仔鼠神經(jīng)發(fā)育毒性的機制研究
　　目的：母鼠孕期及哺乳期暴露NP，觀察對子代神經(jīng)細胞凋亡、神經(jīng)遞質、膠質細胞以及神經(jīng)生長相關基因的表達變化，探討NP對仔鼠神經(jīng)毒性的可能機制。
　　方法：將交配成功的31只孕鼠根據(jù)妊娠日期分層后隨機分配到4組，即C、L、M、H組(NP0、25、50、100mg/kg/day)，單籠飼養(yǎng)，空腹灌胃，NP暴露時間為受孕第6天到出生后21天哺乳期結束(GD6～PND

14、21)，放免法檢測21天仔鼠血清雌二醇(E2)和睪酮(TT)水平；分光比色法測仔鼠海馬組織膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和膽堿酯酶(AchE)活性；免疫組化發(fā)觀察海馬組織即早基因c-fos和c-jun蛋白的表達；原位末端標記法(TUNEL)觀察PND21天和60天仔鼠海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生情況；免疫組織化學法檢測海馬和皮質星形膠質細胞膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)生長相關因子(GAP-43)的蛋白的變化，RealTime PCR法檢測GF

15、AP和GAP-43 mRNA的變化，并分析上述指標變化與NP暴露劑量之間的關系。
　　結果：①NP對斷乳期仔鼠血清激素水平的影響：放免法檢測結果顯示，仔鼠出生后21天血清睪酮水平隨NP暴露劑量增加而降低，存在劑量-效應關系(r=-0.889，p<0.05)，與對照組比較，M和H兩個劑量組睪酮明顯降低(p<0.05)；雌激素水平與NP暴露劑量正相關(r=-0.462，p<0.01)，H劑量組雌激素水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p

16、<0.05)。②NP暴露對斷乳期及成熟期仔鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響：TUNEL法檢測結果顯示，仔鼠出生后21d和60d，H劑量組海馬細胞凋亡率顯著高于對照組(p<0.01)，且NP暴露劑量與凋亡率正相關(r=0.836、0.521，p<0.05)。從縱向比較，各暴露組21天仔鼠海馬組織凋亡率均高于60天(t=3.331，p<0.05)③NP對仔鼠神經(jīng)信號傳導的影響：A.NP對仔鼠海馬組織ChAT和AchE活性的影響：M、H劑量組仔鼠海馬組織

17、ChAT活性明顯低于對照組；M劑量組AchE活性高于對照組(p<0.01)。海馬組織ChAT和AchE活性與NP暴露劑量有劑量效應關系(r=-0.821、0.757，p<0.05)。B.海馬組織c-fos和c-jun蛋白表達的變化：正常仔鼠海馬中c-jun和c-fos蛋白表達很低，L劑量組陽性細胞數(shù)少，著色淺；M和H劑量組仔鼠海馬c-jun和c-fos陽性細胞數(shù)量增多，尤其是高劑量組分布密集，胞體大、著色深。④NP對仔鼠海馬星形膠質細胞

18、膠質原纖維酸性蛋白的影響：免疫組化技術檢測GFAP蛋白表達的結果顯示，H劑量組21d和60d齡的仔鼠海馬和皮質部GFAP免疫陽性反應細胞數(shù)目、積分光密度顯著高于同期對照組仔鼠(p<0.05)，熒光定量PCR檢測GFAP表達的結果顯示，H劑量組21d和60d齡的仔鼠海馬GFAP mRNA表達升高，與對照組比較有顯著性差異。GFAP蛋白與GFAP mRNA表達與NP暴露劑量有正相關關系(p<0.05)。⑤NP對仔鼠神經(jīng)生長相關蛋白的影響：免

19、疫組化技術檢測GAP-43蛋白表達的結果顯示，H劑量組21d和60d齡的仔鼠海馬和皮質部GAP-43免疫反應陽性細胞平均數(shù)目、積分光密度低于同期對照組仔鼠(p<0.05)，熒光定量PCR結果顯示，H劑量組21d和60d齡的仔鼠海馬GAP-43 mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義。GAP-43蛋白和GAP-43 mRNA表達與NP暴露劑量有負相關關系(p<0.05)。
　　結論：結合以上數(shù)據(jù)，推測NP誘導的神經(jīng)毒性可能機制是：在胚胎

20、期及哺乳期接觸NP，NP的弱雌激素樣作用通過競爭雌激素受體引起內分泌系統(tǒng)失衡，導致仔鼠體內雌激素水平升高，改變了子代大腦發(fā)育的內分泌環(huán)境，干擾神經(jīng)細胞發(fā)育過程，降低神經(jīng)營養(yǎng)因子GAP-43的表達水平，抑制神經(jīng)細胞分化，包括神經(jīng)突起生長和分支，突觸的形成，同時通過增加膠質細胞纖維酸性蛋白GFAP表達，并影響星形膠質細胞的形態(tài)、結構和功能，進一步影響膽堿能神經(jīng)遞質Ach以及即早基因c-jun、c-fos的信息傳遞，并且誘導仔鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞