磁共振彌散-張量加權及CT灌注成像對兔肝缺血再灌注損傷的診斷價值.pdf

1、研究背景：
　　 肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,I/R)常發(fā)生于肝移植、低血容量性和心源性休克以及肝臟腫塊和腫瘤的肝葉手術切除中,是肝功能急性損害的重要原因,直接影響患者的恢復和術后生存率。因而,肝I/R損傷保護研究是肝臟外科領域一項重要的課題。肝I/R病理生理過程機制復雜,涉及能量代謝障礙、鈣離子超載、微循環(huán)障礙、細胞因子、中性粒細胞、氧自由基作用等相關因素。目前,對肝I/R損傷程度

2、的評價多采用肝酶(AST、ALT)、炎性因子(TNF-a)等生化檢查指標。雖然這些生化指標可作為一個非常敏感指標反映肝臟損傷程度,但是還不能反映肝I/R后肝組織的形態(tài)學特征、微循環(huán)障礙及其在空間分布等方面的信息。同時,肝酶以及炎性因子等指標還存在受肝臟術后應急性反應、創(chuàng)傷以及溶血等多方面因素影響,由此可能產(chǎn)生假象,造成不必要再手術風險。
　　 磁共振彌散/張量成像(diffusion weighted/tensor imagin

3、g,DWI/DTI)作為研究功能及微觀影像學的重要方法之一,目前已經(jīng)成為臨床評估和生命科學研究重要的工具,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和相關病變的基礎研究已日趨成熟,但應用于腹部臟器還處于探索階段。肝I/R的病理生理過程包括肝臟微循環(huán)的障礙、肝細胞內(nèi)外水腫以及不斷加重的肝細胞壞死等,這些病理過程使細胞內(nèi)外水分子的運動狀態(tài)、肝臟微循環(huán)的灌注量以及肝組織微觀空間結(jié)構發(fā)生改變,這就使DWI/DTI監(jiān)測和評估肝I/R的病理機制及發(fā)生、發(fā)展具有可行性。目前,D

4、WI/DTI對肝I/R的研究尚處于探索階段,各家結(jié)論尚未達成一致。
　　 CT灌注成像(computer tomography perfusion imaging,CTP)具有很高的時間和空間分辨率,作為一種有效、非創(chuàng)性的檢查方法,能夠同時在微血管的水平上直接評估組織的灌注情況和間接反應微血管形態(tài)特征。而肝I/R是多機制、多種因素參與復雜的一個病理過程,其中肝I/R后肝臟微循環(huán)狀態(tài)的差異性分布,即血液動力學的改變及伴隨的肝臟灌注

5、失敗一直被認為是其病理過程中重要的因素之一,這正是如何準確評估肝I/R后肝組織微循環(huán)障礙所面臨的瓶頸所在,是對以往采用肝酶等生化方法來評估肝臟損傷程度的一個很好補充。
　　 本實驗擬采用新西蘭大白兔制作部分肝I/R模型,探討肝I/R后組織病理學、肝功能及TNF-a變化特點,探討3.0 T DWI/DTI及CTP對兔肝I/R診斷價值,以期為肝I/R的診斷和治療提供一種新的評價方法。
　　 第一部分兔部分肝缺血再灌注損傷模型

6、的建立
　　 研究目的：
　　 采用新西蘭大白兔做部分肝I/R模型,擬探討肝I/R后大體形態(tài)、組織病理、肝酶(ALT、AST、ALP)及腫瘤壞死因子a(TNF-a)變化特點,以期為肝I/R后功能影像學研究提供病理學基礎。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗動物：
　　 健康成年、雄性新西蘭大白兔,3～4月,體重2.5～3kg。所用實驗兔術前均經(jīng)腹部CTA檢查了解肝動脈和門靜脈解剖變異情況。

7、　　 2.肝I/R及sham模型的制作
　　 采用部分肝I/R模型,用無損傷性動脈夾夾閉入肝左葉管道結(jié)構(肝左動脈、門靜脈左支及左肝管),肝右葉血供未阻斷。阻斷血供60 min后,打開動脈夾恢復血流,肝左葉由暗紅色變?yōu)轷r紅,表示再灌注成功,關閉腹腔。I/R組按照再灌注時間,分為0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h和48 h組。sham組僅解剖肝十二指腸韌帶,不阻斷血供。
　　 3.生化及病理學檢查
　　

8、 3.1肝酶及TNF-a測定
　　 實驗兔分別于MRI、CT檢查結(jié)束后立即經(jīng)上腔靜脈抽取靜脈血4 ml(肝素管),離心后,分離血清,測定ALT、AST、ALP(U/L)及TNF-a(pg/ml)含量。
　　 3.2病理學檢查
　　 取血樣后,立即處死實驗動物,整體摘取肝臟,肉眼觀察大體標本表面和斷面解剖特點。將解剖標本制成常規(guī)HE染色切片。顯微鏡下觀察肝組織病理學改變,根據(jù)肝臟病變程度以半定量方法積分,按各種病

9、變程度乘以不同加權數(shù):肝細胞壞死×(0～3),肝細胞水腫×(0～3),炎細胞浸潤×(0～3),淤血×(0～3),計算每只動物肝病變的總積分,然后進行統(tǒng)計學處理。
　　 4.統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析:(1)I/R與sham組間肝酶、炎性因子及形態(tài)學積分均進行單因素方差分析(one-way ANOVA)；(2)組織形態(tài)學積分與肝酶、TNF-a間關系采用Pearson相關；P<0.05作為差

10、異有顯著意義的檢驗標準。
　　 結(jié)果：
　　 1.兔肝I/R模型構建
　　 成功造模并納入實驗78只,其中sham、0.5～24 h組,每組各12只:48 h組6只。
　　 2.病理表現(xiàn)及生化檢查
　　 2.1大體解剖
　　 在復血、氧后早期(0.5 h、2 h組),肝左葉表現(xiàn)為顯著的充血腫脹、體積略增大,在其解剖斷面上顯示明顯充血腫脹、肝竇內(nèi)充滿淤積紅細胞；隨著I/R后時間的延長,肝臟表

11、面顏色逐漸變淡,變成蒼白色,在I/R后48 h肝表面出現(xiàn)不規(guī)則墨綠色樣變,肝段性壞死顯著。而未阻斷血供的肝右葉表現(xiàn)為顯著充血腫脹。
　　 2.2鏡下表現(xiàn)
　　 在I/R早期彌漫性肝細胞腫脹,肝細胞內(nèi)明顯水腫,肝竇間隙變窄,中央靜脈、小動脈內(nèi)紅細胞大量淤積、微血栓形成(0.5 h),隨后匯管區(qū)出現(xiàn)成簇中性粒細胞,肝竇稍有萎縮,肝細胞水腫略有減輕,肝竇間及匯管區(qū)紅細胞淤積,并出現(xiàn)少量炎性細胞,部分肝細胞核腫脹、細胞形態(tài)改變(

12、2 h);在I/R后6～12h,肝竇及肝實質(zhì)聚集大量中性粒細胞,出現(xiàn)肝竇阻塞的現(xiàn)象,部分肝組織出現(xiàn)核固縮紅染的凋亡細胞；在后期階段(24～48 h),未發(fā)生梗死的肝組織顯示肝竇萎縮塌陷、解離,梗死區(qū)域細胞結(jié)構消失,出現(xiàn)溶解壞死的特征。
　　 2.3組織評分結(jié)果
　　 各I/R組鏡下形態(tài)學評分值除0.5 h組一過性性的升高外,總體趨勢呈逐漸上升,在48 h達到最峰值。各I/R組與sham組間存在顯著性差異(F=172.70

13、2；P<0.001)。
　　 2.4 AST、ALT、ALP及TNF-a
　　 各I/R組血清ALT(F=325.531,P<0.001)、AST(F=1009.602,P<0.001)、ALP(F=1430.899,P<0.001)與sham間均存在顯著性差異。ALT峰值在再灌注后6 h組,I/R后12～48 h逐漸下降。AST在2 h顯著升高后,緩慢上升,在48 h達到最高值；ALP在6 h迅速升高,在I/R后24～

14、48 h維持峰值。
　　 I/R組血清TNF-a在再灌注后2 h迅速升高,并在I/R后12～24 h維持峰值,在48 h組開始回落。而sham組,TNF-a保持在一個穩(wěn)定的低水平。經(jīng)統(tǒng)計學分析,各I/R組與sham間均存在顯著性差異(F=172.702,P<0.001)。
　　 3.相關性分析
　　 組織形態(tài)學積分與TNF-a(r=0.788,P<0.001)、ALP(r=0.841,P<0.001)、AST(r

15、=0.848,P<0.001)之間存在顯著相關性。
　　 結(jié)論：
　　 1.兔肝I/R模型制作簡單、成功率高,并在復血、氧后48 h多個時間點觀察了其病理發(fā)生、發(fā)展過程,適合功能影像評價肝I/R實驗研究的需求。
　　 2.肝I/R早期以肝細胞水腫、肝竇淤血等病理過程為主(0～2 h)；晚期階段是以肝細胞凋亡、壞死為主(6～48 h)。對損傷反應的差異性是其病理病理特點之一。
　　 3.肝細胞水腫、淤血、中

16、性粒細胞浸潤、TNF-a等因素是誘導肝I/R發(fā)生、發(fā)展的重要因素；組織形態(tài)學積分與肝酶、TNF-a具有顯著相關性。
　　 4.肝I/R后中性粒細胞聚集、內(nèi)皮細胞損傷、微循環(huán)障礙、肝竇萎縮、塌陷以及局灶性壞死等的病理變化特點為其功能成像學研究提供了病理學基礎。
　　 第二部分兔部分肝缺血再灌注損傷3.0T彌散加權/張量成像
　　 研究目的：
　　 旨在結(jié)合肝酶、腫瘤壞死因子(TNF-a)和病理學檢查,探討3

17、.0 T DWI/DTI對兔肝I/R可行性及診斷價值。
　　 材料與方法：
　　 1.動物模型的制作及分組
　　 實驗兔分為sham與I/R組。肝I/R模型及sham組制作同第一部分。I/R組按照再灌注時間,分為0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h與48 h組。I/R與sham,每組各6只。
　　 2.檢查方法及參數(shù)
　　 采用GE3.0T Signa Excite掃描儀,8通道頭正交線

18、圈,軸位掃描。掃描參數(shù):T2WI TR/TE3200/85ms,矩陣288×224,層厚4 mm,NEX3,FOV20 cm×15 cm；T1WI TR/TE8.5/4 ms,矩陣288×192,層厚4 mm,NEX,3,FOV22 cm×22 cm；EPI-DWI,TR/TE2000/49.3 ms,矩陣128×128,層厚4 mm,NEX,4,FOV20cm×10 cm；彌散方向:ALL模式(X、Y、Z三個方向)。彌散梯度因子b=5

19、0、100、200、300、500、600s/mm2；EPI—DTI序列,TR/TE2000/49.3 ms,NEX,4,FOV20 cm×10 cm,層厚4 mm,矩陣128×128。b=100、300、600 s/mm2。彌散方向:取6個方向同時進行；增強掃描采用T1WI增強,0.2 mmol/kg順磁性對比劑Gd-DTPA及8 ml生理鹽水快速手動注入。
　　 3.MR圖像分析
　　 采用GE AW4.3 Func

20、Tool Performance工作站進行后處理,先對原始圖像采用Correction程序?qū)D像進行校正,以減少偽影和圖像變形。重建出表觀擴散系數(shù)(ADC)、平均擴散系數(shù)(DCavg)及各項異性系數(shù)(FA)圖。感興趣區(qū)(ROI):15～18 mm2,分別測量ADC、DCavg及FA值,連續(xù)測量三個層面,取其平均值。
　　 4.組織學和生化檢查
　　 同第一部分。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 使用SPSS1

21、3.0軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以不同b值時MR-DWI/DTI參數(shù)作為因變量,肝酶、TNF-a及組織形態(tài)學積分作為自變量行多元線性回歸分析,用復相關系數(shù)R來說明MR-DWI/DTI參數(shù)與肝酶、TNF-a及組織形態(tài)學積分的相關關系。
　　 結(jié)果：
　　 1.影像學表現(xiàn)
　　 在0.5 h組肝左葉T2WI信號彌漫性輕度增高,

22、T1WI強化減低。而在2 h組肝組織信號出現(xiàn)暫時性回復正常。再灌注后6～12 h,肝臟的邊緣出現(xiàn)T2WI上不均勻性點片狀稍高信號以及相對應的強化減低區(qū)域。24 h及48 h組,出現(xiàn)明顯的片狀、楔形或整個肝段高信號(T2WI、DWI)及無強化的梗死區(qū)域,與未發(fā)生壞死的區(qū)域分界較為明顯。隨著損傷加重,梗死范圍(強化減低區(qū)域)逐漸擴大。
　　 2.ADC值變化規(guī)律
　　 ADC的總體變化趨勢是先顯著下降(0.5 h),再一過性

23、升高(2 h),經(jīng)過6～12 h緩慢上升后,24 h再出現(xiàn)一個明顯減低后,在48 h明顯升高。
　　 當b≤300 s/mm2時,0.5 h(均P<0.001)和24 h組ADC顯著低于sham組(b=50 s/mm2,P=0.037；b=100s/mm2,P=0.020；b=200 s/mm2,P=0.016；b=300s/mm2,P=0.001)。值得注意是,ADC于2 h組明顯升高(b≤300 s/mm2較為顯著),雖與s

24、ham組之間無明顯差異。在6 h組ADC顯著升高,但仍低于sham組(b=50 s/mm2,P=0.029;b=200 s/mm2,P=0.013；b=300 s/mm2,P=0.021)。12 h組與sham間均無統(tǒng)計學差異。與sham對比,48 h組ADC顯著升高(b≥300 s/mm2,均P<0.001)。
　　 3.DCavg值變化規(guī)律
　　 各I/R組DCavg與ADC變化特點基本類似:在0.5 h組顯著下降,

25、且在b=100(P<0.001)、300 s/mm2(P=0.008),與sham組間差異存在統(tǒng)計學意義；在I/R后2 h顯著升高,并在b=100s/mm2時,與sham組間存在統(tǒng)計學意義(P=0.021)；b=100 s/mm2(P=0.021)、300 s/mm2(P=0.002)時,6 h組較sham組顯著升高；DCavg值于24 h組也出現(xiàn)一過性下降現(xiàn)象,并在b=100 s/mm2(P=0.008)、300s/mm2(P=0.0

26、42)時,低于sham組；在I/R后48 h顯著升高,且隨著b值增大,其與sham組間差異性越顯著(b=300 s/mm2,P=0.012；b=600 s/mm2,P=0.002)。
　　 4.FA值變化特點
　　 在I/R早期(0.5 h)FA顯著升高(b=100 s/mm2,P=0.032；b=300 s/mm2,P<0.001)、2 h顯著減低(b=100 s/mm2,P<0.001；b=300 s/mm2,P=0

27、.004),并與sham組間差異均存在統(tǒng)計學意義。FA在6～12h組緩慢下降,與sham間無統(tǒng)計學差異。隨著肝I/R損傷加重,FA在I/R后24～48 h呈下降趨勢,并在24h(b=300s/mm2,P=0.018；b=600s/mm2,P=0.006)、48 h(b=100s/mm2,P=0.044；b=300s/mm2,P<0.001；b=600s/mm2,P<0.001)與sham組間存在顯著性差異。
　　 5.I/R與s

28、ham組血清肝酶及TNF-a
　　 I/R組血清ALT(F=121.404,P<0.001)、AST(F=489.615,P<0.001)、ALP(F=835.325,P<0.001)與sham對比顯著升高,組間存在顯著性差異。
　　 I/R組血清TNF-a水平明顯升高,與sham組間存在顯著性差異(F=171.803,P<0.001)。
　　 6.I/R及sham組組織形態(tài)學積分
　　 各I/R組鏡下形

29、態(tài)學積分總體趨勢呈逐漸上升,與sham組間存在顯著性差異(F=119.350,P<0.001)。
　　 7.多元線性回歸分析
　　 ADC(b=100 s/mm2,R=0.756；b=500/mm2,R=0.782),FA(b=300 s/mm2,R=0.781)與肝酶等生化、病理指標間存在較好的相關性。
　　 結(jié)論
　　 1.肝I/R功能成像參數(shù)ADC、DCavg/FA具有復雜性和多變性特點,其成像參數(shù)

30、在I/R后2 h出現(xiàn)一過性回復的現(xiàn)象,與組織形態(tài)學積分等病理指標具有類似變化特點,是其病理機制的體現(xiàn)。
　　 2.在肝I/R組早期功能成像參數(shù)變化較為劇烈(b<300 s/mm2),這可間接反映肝微循環(huán)障礙等病理信息；采用較大b值(b=500、600 s/mm2),在I/R后期階段功能成像參數(shù)與sham間具有較大差異,這對于準確反映I/R后肝組織損傷、壞死等病理過程具有重要意義。
　　 3.在肝I/R早期階段,FA與DC

31、avg變化呈相反的趨勢(0.5～12 h)；而在晚期階段呈現(xiàn)逐漸下降特點(24～48 h),這與肝I/R后肝組織不斷溶解壞死,維持其正常微觀空間結(jié)構消失相一致。
　　 4.肝酶等生化指標與ADC、DCavg/FA參數(shù)間存在較好的相關性,證實了DTI/DWI對肝I/R診斷可行性和臨床應用價值。
　　 5.DTI/DWI可以作為一種非創(chuàng)性的功能成像反映肝I/R肝細胞的生理狀態(tài)、微觀形態(tài)學等方面信息,若結(jié)合其他功能成像方法,例

32、如,灌注成像可促進對I/R模型探索研究,為臨床的斷和治療提供了一種可行性評價方法。
　　 第三部分兔部分肝缺血/再灌注損傷CT灌注成像：
　　 研究目的：
　　 觀察兔部分肝I/R后CT灌注(CTP)參數(shù)演變規(guī)律,分析CTP評估肝I/R血流動力學病理基礎,并探討對其最敏感、有效的灌注參數(shù)。
　　 材料與方法：
　　 1.動物模型的制作及分組
　　 實驗兔分為sham與I/R組。肝I/R模型

33、及sham制作同第一部分。I/R組按照再灌注時間,分為0.5 h、2 h、6 h、12 h與24 h組。I/R與sham,每組各6只。
　　 2.CT灌注檢查方法
　　 采用Philips Brilliance iCT(探測器組合0.625 mm×256)掃描儀,定位掃描后,確定灌注掃描范圍,然后采用全肝灌注模式(JOG)對全肝及脾動態(tài)掃描。非離子型對比劑(5 ml優(yōu)維顯,370 mgI/ml)和生理鹽水10 ml。注射

34、速率均為1.5 ml/s,對比劑注入后延遲2 s開始掃描,掃描時間1.5 s,共掃描11次,掃描間隔3 s。掃描參數(shù):探測器128×0.625 mm,層厚1 mm,間距-0.5 mm,Pitch0.915,80 Kv,100 mAs,360°/0.4 s。
　　 3.圖像后處理
　　 采用EBW4.0I Philips工作站,自動生成肝動脈灌注量(HAP)、門靜脈灌注量(HPP)、總灌注量(TLP)、灌注指數(shù)(HPI)等

35、灌注圖。肝組織ROI的選取:0.5～3 cm2。在I/R后2 h內(nèi),ROI隨機分布的肝左葉,每個層面測量3個ROI,連續(xù)測量三個層面；I/R后6～24 h在梗死區(qū)域(低灌注區(qū),即強化減低肝組織)與未梗死區(qū)(相對正常的強化未減低肝組織)分別測量3個ROI,連續(xù)測量三個層面,計算出梗死與未梗死肝組織的平均值以及相應平均值。
　　 4.組織學和生化檢查
　　 同第一部分。
　　 5.統(tǒng)計學分析
　　 采用SPS

36、S13.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)。采用配對t檢驗比較以下CT灌注參數(shù)間有無統(tǒng)計學意義:(1)在6 h、12 h、24 h組梗死與未梗死肝組織灌注參數(shù)比較；(2)sham與6 h、12 h、24 h組肝左葉梗死肝組織灌注參數(shù)比較；(3)sham與6 h、12 h、24 h組未梗死肝組織灌注參數(shù)比較。以梗死與未梗死肝組織中CT灌注參數(shù)為因變量,肝酶、TNF-a及組織形態(tài)學積分為自

37、變量進行多元線性回歸分析。用復相關系數(shù)(R)來說明CT灌注參數(shù)與肝酶、TNF-a及組織形態(tài)學積分的相關關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.各I/R與sham組間CT灌注變化特點
　　 與sham組相比,0.5 h組表現(xiàn)為整個肝左葉的顯著強化減低,2 h組表現(xiàn)為明顯均勻強化,在I/R后6 h兔肝左葉呈現(xiàn)差異性灌注(低灌注區(qū)出現(xiàn),即強化減低區(qū)),且隨著再灌注時間的延長(12～24 h),梗死

38、的范圍逐漸擴大,強化程度也呈減低趨勢。
　　 2.CT灌注參數(shù)變化特點
　　 2.1總的變化趨勢
　　 CT灌注參數(shù)在I/R早期(0.5 h組)除HPI外,均表現(xiàn)為顯著減低；HAP于2 h顯著升高后,在I/R后6～24 h均表現(xiàn)為逐漸下降；HPP一直低于sham,尤其是在I/R后0.5～2 h；TLP變化特點與HAP基本類似。HPI作為相對性指數(shù),各I/R組均高于sham組。
　　 2.2梗死及未梗死肝組

39、織CT灌注參數(shù)的變化特點
　　 HAP于6 h組梗死肝組織顯著上升后,在12 h、24 h組呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,而在未梗死的肝組織中HAP是呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(6～4 h)；HPP不論在梗死或未梗死的肝組織均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢,但在梗死的肝組織內(nèi)下降的幅度更大；TLP在梗死以及未梗死肝組織中變化特點與HPP基本類似；在梗死的肝組織內(nèi)HPI顯著升高,這也說明了肝動脈緩沖效應機制作用。
　　 3.相關性分析
　　 在

40、肝I/R后梗死組織CT灌注參數(shù)與肝生化指標及組織形態(tài)學等多個自變量間的具有較好的線性相關,以梗死組織中HPP相關性最好(R=0.855)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在肝I/R后2 h,CT強化模式以及CT灌注參數(shù)出現(xiàn)暫時性回復,是其“假正?；辈±頇C制的體現(xiàn)。
　　 2.在肝I/R后6 h出現(xiàn)了灌注性差異,且隨著時間的延長,其強化程度逐漸減低,梗死的范圍逐漸擴大(12～24 h),在I/R后24 h出現(xiàn)局灶性壞死

41、。
　　 3.肝I/R后,CT灌注參數(shù)出現(xiàn)了顯著的差異性,在強化減低肝組織中I/R早期(2 h)HAP顯著升高,而HPP明顯降低,TLP保持相對穩(wěn)定；HAP在梗死的肝組織(12～24 h)明顯高于未梗死的肝組織-肝臟動脈緩沖效應基礎機制的存在。
　　 4.HAP在梗死的肝組織中雖明顯升高(12～24 h),但HPP與TLP顯著降低,其根本原因是肝內(nèi)門體分流(末端小動靜脈開放),致使肝動脈緩沖效應作用降低,最終導致門靜脈的