心臟干細胞分泌的外泌體對氧化應激損傷下心肌細胞保護性作用的機制研究.pdf

1、心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命的主要疾病之一。心肌缺血性疾病如動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷以及心力衰竭等都有一個相同的病理改變，即在病變的區(qū)域產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，活性氧的累積會造成心肌細胞的凋亡和壞死，進而加速心臟疾病的病理進程。因此，研究者們正在急切地尋求一個有效的治療手段來緩解氧化應激對心血管系統(tǒng)的損傷。
　　干細胞移植在缺血性心肌病的治療中具有廣泛的應用前景，不同來源

2、的干細胞的移植都被證實可以在不同程度上提高心功能，其中包括成體自體心臟固有的干細胞——心臟干（祖）細胞(Cardiac progenitor cells，CPCs)，由于其來源于自體的組織，可以很好地避免異體移植排斥效應，因此越來越受眾多研究者關注。但是，心臟干細胞對于心肌保護的作用的機制目前還有待進一步闡明，通常移植后干細胞的常規(guī)生理過程包括:干細胞注射到病變區(qū)域、著床、分化，然后替代損傷的心肌組織。盡管干細胞直接的分化作用和間接的旁

3、分泌效應都已經被證實是干細胞心肌修復作用的潛在機制，但是近幾年來越來越多的證據(jù)顯示移植后的干細胞效應主要來自于干細胞的旁分泌作用，干細胞可以分泌出多種旁分泌因子，這些因子在減少原有的心肌損傷和促進受損區(qū)域細胞的修復能力等方面都具有重要作用。
　　過去的幾年中，許多研究者證實CPCs分泌的一種名叫外泌體(exosomes)的雙層膜的納米級細胞外囊泡可以顯著改善受損心臟的心功能。Exosomes是一種直徑在30-100nm的膜性囊泡，

4、是囊泡轉運家族的重要組成部分，可以將里面包裹的眾多轉錄因子、小非編碼RNA(microRNA，miRNAs)、長鏈非編碼(longnon-coding RNA) RNA(lncRNA)等成分通過與目的細胞融合的方式傳遞到靶細胞中，進而調控細胞中一些重要的信號通路。CPCs通過分泌exosomes，攜帶一些CPC中可以改善心肌損傷重要因子，傳遞到心肌細胞內，從而發(fā)揮心肌保護作用。但是exosomes的內容物會根據(jù)病理條件的不同而發(fā)生改變，

5、不同的因子就會導致靶細胞會有不同的命運。因此，對于處在特定病理條件下的exosomes內容物的探究非常必要且有意義，
　　目的：
　　本研究主要探究CPCs分泌的外泌體中對于活性氧累積導致的心肌損傷中發(fā)揮關鍵作用的miRNAs以及其調控機制。
　　方法:
　　1.采用干細胞表面抗原(stem cell antigen-1，Sca-1)標記免疫磁珠，分選帶有這種特定表型的成年小鼠的心臟干細胞，用免疫熒光鑒定其表型，

6、流式細胞術分析分選前后Sca-1陽性的細胞比例;收集CPCs培養(yǎng)48h后的培養(yǎng)上清，用ExoQuick外泌體提取液對CPCs分泌的exosomes進行提取，用納米粒子示蹤儀(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)對exosomes進行粒徑分布以及濃度的分析，透射電鏡進一步觀察exosomes的超微結構，最后用Western blot對其表面標記(CD9、CD63、Alix)進行定性鑒定;免疫熒光檢測H9C

7、2細胞對膜染料PHK-26標記后的exosomes的攝取情況;
　　2.用過氧化氫模擬心肌受損時氧化應激的環(huán)境，確定過氧化氫的濃度，處理CPC，NTA分析用該濃度過氧化氫處理前后分泌exosomes量的差異;選擇13個與本研究相關的miRNAs，RT-qPCR解析在exosomes里面可能包含的miRNAs，并比較氧化應激刺激前后exosomes內的miRNAs的差異(miR-X);
　　3.用RT-qPCR檢測miR-X在

8、氧化應激損傷的心肌細胞中表達差異，TargetScan預測差異miR-X的靶基因，轉染miR-X模擬物和抑制物Western Blot檢測靶蛋白的變化，驗證miR-X與靶蛋白相互調節(jié)在心肌細胞氧化應激導致?lián)p傷的作用，采用雙熒光素酶報告基因實驗對miR-X與靶蛋白的直接結合效應進行驗證;
　　4.分別用CPC共培養(yǎng)、正常exosomes和過氧化氫刺激后的exosomes預處理心肌細胞，再對心肌細胞進行氧化應激損傷處理，RT-qPCR

9、檢測miR-X的改變，WB檢測細胞中miR-X的靶蛋白和凋亡相關蛋白caspase-3的表達水平，流式細胞儀檢測AnnexinⅤ/PI雙染后處于各時期細胞的比例，反映細胞的凋亡水平。
　　結果:
　　1.原代培養(yǎng)的CPCs形態(tài)呈不規(guī)則的梭形，流式細胞儀對分選前后的細胞進行表面標記物Sca-1陽性比例的分析，結果顯示，分選后Sca-1+細胞的比例較分選前顯著增加（95.04±4.29％ vs.1.31±0.42％），免疫熒光結

10、果提示，分選后CPC幾乎全部表達分選標記Sca-1蛋白;CPCs培養(yǎng)上清離心之后有明顯白色沉淀沉積于管底，NTA結果檢測出exosomes的粒徑分布范圍以及濃度，結果發(fā)現(xiàn)大部分粒子都處于exosomes直徑的范圍(30-100nm)，含量最多的粒子直徑約為83nm，濃度為9.16×109個/ml.投射電鏡檢測到雙層膜的直徑在100nm左右的囊性小泡，進一步用Western Blot分析該白色沉淀發(fā)現(xiàn)，我們所提取出的物質陽性表達CD63、

11、CD9、Alix蛋白;exosomes被PKH26標記后，與H9C2細胞中共孵育12h后，免疫熒光可見大量紅色物質在胞漿聚集;
　　2.隨著過氧化氫處理濃度增加，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化光，鏡下可見細胞皺縮漂浮甚至死亡，用Western Blot發(fā)現(xiàn)cleaved caspase-3表達明顯增加，100μM效果明顯，且細胞無致死性損傷，因此本研究采用100μM H2O2作為氧化應激損傷濃度。Exosomes的NTA計數(shù)結果顯示，與正常

12、CPC(Nor-CPC)相比((1.31±0.29)×109)，100μM H2O2可以促使CPCs（H2O2-CPC）分泌較多的exosomes((3.36±0.66)×109); qPCR結果顯示，可以在Nor-CPC的exosomes(Nor-exo)和H2O2-CPC的exosomes(H2O2-exo)成功擴增出6個相關的miRNAs(miR-21，24，214，132，195，210)，且miR-21在Nor-exo和H2O

13、2-exo表達水平具有顯著性差異;對轉染miR-21的模擬物和抑制物后，Western blot結果顯示，過表達miR-21后激活型caspase-3的表達顯著下調，而抑制miR-21的表達可顯著上調激活型caspase-3，提示miR-21在H9C2細胞中是重要的抗過氧化氫誘導的凋亡因子。
　　3.Target Scan預測出，在不同種屬來源的PDCD4 mRNA的3'UTR的不同區(qū)域，都有一段相對保守的miR-21的結合位點。

14、Western blot結果發(fā)現(xiàn)，心肌細胞中PDCD4的表達水平隨著過氧化氫處理濃度的增加而表達上調。并且在過表達miR-21后，PDCD4的表達受到顯著抑制，而抑制miR-21后PDCD4表達上調;熒光素酶報告基因發(fā)現(xiàn)，轉染了野生型的PDCD4載體同時又過表達細胞內miR-21的細胞中，熒光素酶的活性顯著降低，證實miR-21與PDCD4是通過直接的結合而發(fā)揮抑制作用。
　　4.在氧化應激處理之前給予exosomes進行預保護后

15、，exosomes可以明顯提高細胞中miR-21的水平，且細胞中cleaved caspase-3和PDCD4的蛋白水平明顯降低。AnnexinⅤ/PI雙染流式分析，結果發(fā)現(xiàn)，與H2O2-ctrl組33.29％的凋亡率相比較，H2O2-exo預保護細胞的凋亡率降低至13.58％，而Nor-exo的預保護也有一定作用，但凋亡率只降低至17.39％，不如H2O2-exo預保護作用明顯。
　　結論:
　　1.成年小鼠CPCs含量有

16、限，用免疫磁珠特異性結合的方式可以分離出純度較高、且較為特異的Sca-1+的心臟干細胞，CPCs同大多數(shù)細胞類型一樣，可以分泌出exosomes，且分泌exosomes的濃度與內容物會根據(jù)細胞所處微環(huán)境的變化而改變;并且exosomes可以被H9C2細胞所攝取;
　　2.氧化應激刺激下的CPCs分泌較多exosomes，并且其中的miR-21出現(xiàn)顯著差異;氧化應激可以引起心肌細胞凋亡，且發(fā)生凋亡時miR-21顯著降低，說明miR-

17、21與氧化應激導致的心肌細胞的凋亡密切相關;
　　3.PDCD4作為miR-21的靶基因，參與到miR-21調控的凋亡過程之中，正常細胞受到miR-21對PDCD4的抑制調控，一旦發(fā)生氧化應激的刺激，細胞miR-21下降導致PDCD4抑制被解除，進而使細胞容易發(fā)生凋亡;
　　4.氧化應激刺激CPCs后分泌的Exosomes的預保護可明顯緩解心肌細胞由于氧化應激所致的凋亡，與這種exosomes中包含大量的miR-21密切相關

18、，大量的miR-21傳遞到心肌細胞后重建了心肌細胞內的miR-21/PDCD4負調節(jié)，降低細胞中PDCD4的表達，進而緩解心肌細胞凋亡。
　　因此，本研究主要闡明了心臟干細胞分泌的exosomes在缺血性心肌損傷的疾病模型中對于心肌細胞的保護性作用，首次提出干細胞心肌修復作用的系統(tǒng)性機制是通過exosomes傳遞miR-21到心肌細胞中調控PDCD4來完成的，為闡明干細胞治療心肌梗死的作用機制提供了新的視野，并有可能開辟一個潛在的