游離脂肪酸對胰島微血管內(nèi)皮細胞的脂毒性及非諾貝特的保護作用.pdf

1、生理水平的游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）在機體內(nèi)起著重要的生理作用，不但為組織器官提供能量，而且是胰島β細胞釋放胰島素所必需。然而，血游離脂肪酸水平長期升高時，肝臟、骨骼肌、脂肪組織等不能將FFA氧化和轉(zhuǎn)化為甘油三酯，使FFA沉積于非脂肪組織而對組織和細胞的功能和代謝造成損害，又稱為游離脂肪酸的脂毒性。研究表明，胰島素抵抗患者、肥胖癥和2型糖尿病患者往往存在空腹和餐后高游離脂肪酸血癥。近年來，血漿游離脂肪酸升高

2、對細胞的脂毒性，成為糖尿病病理生理機制研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征患者血管組織長期暴露于高FFA環(huán)境中，血管形態(tài)和功能可受到明顯損害。綜上所述，采用適當?shù)拇胧└深A(yù)胰島素抵抗患者FFA誘導(dǎo)的損傷是非常必要的。 本研究采用含有軟脂酸的培養(yǎng)液與胰島內(nèi)皮細胞株MS-1共孵育，模擬血漿游離脂肪酸的作用，評估游離脂肪酸對胰島內(nèi)皮細胞增殖率和凋亡的影響，探討胰島素抵抗及糖尿病患者胰島微血管損害的可能機制。 氯貝丁酸類藥包括非諾

3、貝特、吉非貝特、氯貝丁酯，是過氧化物酶體增殖物激活受體-α（（peroxisome proliferators-activated receptor-α，PPARα）的人工合成配體，作為調(diào)脂藥物已經(jīng)在臨床上使用了三十余年。研究已經(jīng)證實氯貝丁酸類藥物可以調(diào)節(jié)眾多基因的轉(zhuǎn)錄，包括線粒體脂質(zhì)過氧化物酶體和微粒體中與脂肪酸氧化有關(guān)的基因，對于脂肪酸的生物氧化、脂肪貯存均具有關(guān)鍵的作用。近年的研究表明氯貝丁酸類藥物還具有有益的非調(diào)脂作用，例如抗氧

4、化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤細胞增殖、抗微血管病變、保護微血管內(nèi)皮等作用。 2005年和2007年報導(dǎo)的大型FIELD（Fenofibrate Intervention and Event Lowering in Diabetes）臨床研究證實，2型糖尿病患者長期使用非諾貝特治療可顯著減少糖尿病患者微血管事件，可以顯著延緩糖尿病患者已有視網(wǎng)膜微血管病變的進一步發(fā)展，證實非諾貝特對微血管的保護作用。實驗研究證實非諾貝特可通過多種機制對腎小

5、球內(nèi)皮細胞起保護作用。 本研究采用非諾貝特進行干預(yù)，初步探討游離脂肪酸損傷IMEC的機制以及非諾貝特的保護作用，為臨床干預(yù)游離脂肪酸介導(dǎo)的胰島微血管損傷提供實驗依據(jù)。 第一章、游離脂肪酸誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細胞凋亡的研究。 研究目的： 觀察軟脂酸對胰島微血管內(nèi)皮細胞株MS-1增殖率、凋亡率的影響。 研究方法： 1.細胞培養(yǎng)：MS-1細胞使用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％

6、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d換一次液，4-5d傳代一次。 2.軟脂酸DMEM培養(yǎng)液制備：軟脂酸溶于無水酒精，置于通風櫥中過夜干燥。加入相當分子量的NaOH溶液，加熱溶解，制成皂化液。使用前加熱溶解，加入含1％BSA的DMEM完全培養(yǎng)基中，磁力攪拌器攪拌4h，制備成含有1.0mmol/L軟脂酸的DMEM工作液。 3.試驗分組：研究設(shè)置對照組和軟脂酸試驗組，分別用含1％BSA的DMEM培養(yǎng)基和含有0.5mmol/L、1.0m

7、mol/L軟脂酸和1％BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。 4.MTT細胞增殖率試驗：處于對數(shù)生長期的MS-1細胞制備成最終濃度為1×105/mL的細胞-DMEM懸液接種于96孔板。與含有不同軟脂酸的DMEM工作液，培養(yǎng)12小時，加入20μLMTT（5mg/mL），避光37℃，5％CO2孵育4小時，加入DMSO，震蕩混勻后于酶標儀上測定490nm的OD值。計算細胞增殖率：細胞增殖率=樣本OD/對照組OD均數(shù)×100％。 5.熒光

8、顯微鏡檢測凋亡細胞將軟脂酸孵育后的細胞行AnnexinV-FITC/PI雙染色，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。 6.流式細胞儀檢測凋亡細胞：對照組和實驗組的細胞用胰酶消化后，經(jīng)AnnexinVFITCF/PI雙染色后用流式細胞儀檢測凋亡細胞。 7.數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用SPSS13.0分析，所有各組所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗符合正態(tài)分布后行相應(yīng)分析，單因素設(shè)計資料數(shù)據(jù)采用one-wayANOVA分析組間差異顯著性

9、，析因設(shè)計資料的組間差異顯著性檢驗使用析因方差分析，組間兩兩比較使用LSD法（滿足方差齊性時）或：Dunnett'sT3法（不滿足方差齊性時），P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.采用不同濃度的FFA（0、0.5、1.0mmol/L）處理生長于正常培養(yǎng)液中的MS-1細胞，37℃、5％CO2溫育12h后MTT結(jié)果顯示，與對照組細胞增殖率比較，培養(yǎng)液軟脂酸濃度升高，MS-1細胞增殖率隨之顯著降低，效應(yīng)呈濃度依賴性

10、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.986，P<0.001）。 2.熒光顯微鏡觀察細胞凋亡：將試驗組標本置于熒光顯微鏡下觀察，可見細胞爬片上散落著被AnnexinV-FITC染色細胞表面顯示綠色熒光的凋亡細胞，以及細胞表面顯示綠色熒光、胞核被PI染色顯示紅色熒光的壞死細胞。 3.流式細胞儀檢測凋亡細胞：流式細胞儀分析顯示，與對照組凋亡率[（6.27±2.12）％]比較，軟脂酸作用適當時間可使MS-1細胞凋亡率顯著升高，差異具

11、有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），隨著FFA濃度升高、作用時間延長，該細胞的凋亡率顯著升高（P<0.05）。 結(jié)論： 高游離脂肪酸水平長期作用顯著降低胰島微血管內(nèi)皮細胞的活力（細胞增殖率），隨著FFA濃度升高、作用時間延長，該細胞的凋亡率顯著升高，提示高FFA水平可對該內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能造成損害。 第二章、非諾貝特對FFA誘導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細胞損害的干預(yù)作用。 研究目的： 1.研究過非諾貝特對于游

12、離脂肪酸（FFA）介導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細胞（IMEC）凋亡的干預(yù)作用。 2.檢測MS-1細胞一氧化氮（nitricoxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxideDismutase，SOD）和丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量，研究游離脂肪酸（FFA）介導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細胞（IMEC）氧化應(yīng)激損傷以及非諾貝特的干預(yù)作用。 研究方法： 1.試驗分組：設(shè)置4個分組，分別為對照組、軟脂酸

13、組、低濃度非諾貝特干預(yù)組和高濃度非諾貝特干預(yù)組?？瞻讓φ沼煤?％BSA的DMEM培養(yǎng)基；軟脂酸組用含有1.0mmol/L軟脂酸和1％BSA的DMEM培養(yǎng)液；低濃度非諾貝特干預(yù)組和高濃度非諾貝特干預(yù)組提前先用含有10μM或40μM非諾貝特的DMEM培養(yǎng)液孵育24h，繼而用含有相應(yīng)濃度非諾貝特和1.0mmol/L軟脂酸、1％BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行各項分析。 2.MTT細胞增殖率試驗：同第一章。

14、3.流式細胞儀檢測凋亡細胞：方法同第一章。 4.NO、SOD、MDA的測定：各組MS-1細胞采用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取細胞培養(yǎng)上清檢測上清NO含量；剩余細胞和培養(yǎng)液用反復(fù)凍融法粉碎細胞（重復(fù)3次），混勻后得到細胞混合液，用以檢測SOD和MDA濃度。 5.數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用SPSS13.0分析，所有各組所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗符合正態(tài)分布后行相應(yīng)分析，單因素設(shè)計資料數(shù)據(jù)采用one-wayANOVA分析組間差異

15、顯著性，組間兩兩比較使用LSD法（滿足方差齊性時）或Dunnett'sT3法（不滿足方差齊性時），P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.MTT試驗分析：1.0mmol/L軟脂酸培養(yǎng)24小時使MS-1細胞增殖率顯著降低，降幅達83.8％（P<0.001），非諾貝特可顯著減輕該作用，使細胞增殖率顯著上升，并且非諾貝特濃度升高細胞增殖率隨之升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P<0.001）。 2.MS-1細胞凋亡

16、率檢測：1.0mmol/L，軟脂酸顯著升高MS-1細胞凋亡率（P<0.001），與之比較，非諾貝特干預(yù)組細胞凋亡率升高顯著降低（P<0.001），隨著非諾貝特濃度升高，細胞凋亡率顯著降低（P=0.001），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2所示。 3.軟脂酸組MS-1細胞培養(yǎng)液中的NO含量顯著下降，與之比較非諾貝特干預(yù)組NO含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。隨非諾貝特濃度升高，NO含量也輕度升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P

17、=0.001）。 4.軟脂酸組培養(yǎng)液和細胞內(nèi)的SOD總活力顯著降低，非諾貝特干預(yù)組與軟脂酸組比較SOD總活力上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。高濃度與低濃度非諾貝特組相比，SOD水平略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。軟脂酸組MDA濃度顯著升高，非諾貝特干預(yù)組MDA水平有效降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。高、低濃度非諾貝特干預(yù)組的MDA濃度相近，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：