中藥藥效成分分析中的色譜新方法研究.pdf

1、隨著中藥現(xiàn)代化進程的不斷前進,中藥藥效的物質(zhì)基礎、藥理學、藥物代謝過程及相關的生物學、藥物的質(zhì)量控制等等方面的研究越來越成為中藥現(xiàn)代化的關鍵問題。運用現(xiàn)代分析儀器,發(fā)展高效的分離分析手段和方法,為解決此類問題提供了一個契機。色譜作為一種現(xiàn)代分離分析手段,在中藥的開發(fā)和研究方面發(fā)揮了非常重要的作用,尤其是在中藥有效成分的定性定量分析及質(zhì)量控制上。但是中藥成分復雜,結構多樣性、含量差別等等干擾分析的因素諸多。單純采用單一色譜系統(tǒng),不能提供中

2、藥全面的信息。利用多種色譜模式的串聯(lián),以及其與其他化學、生物技術的有效結合,可以從不同角度探討中藥的化學組成,以及相關的藥效關系,更好地解決中藥復雜體系的分離與分析,并為高通量篩選中藥中有效組分提供物質(zhì)依據(jù)。
　　 本論文主要發(fā)展和研究了以色譜分離技術為基礎的多種分離分析模式,包括建立納升液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于中藥中標準物質(zhì)的質(zhì)量分析;優(yōu)化多維色譜系統(tǒng)用于中藥分離;以兩維色譜為基礎結合體外酶模型和細胞模型查找相關的有效成分;利用新型材

3、料固定靶酶,通過色譜/質(zhì)譜等技術檢測固定酶的活性并運用于相關抑制劑的篩選。具體的研究工作和成果的摘要如下:
　　 第一章作為前言簡單回顧了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展,闡述了中藥藥效研究的基本思路和策略;綜述了中藥研究中的各類化學分析方法;重點描述了色譜在中藥研究中的重要作用和近幾年來的發(fā)展,以色譜分析前的預處理提取方法為始,舉例說明了新型色譜技術在中藥定性定量剖析、復雜體系分離分析以及高通量藥物篩選中的研究和應用。同時也概述了其他新技術新

4、方法與色譜分析技術結合在中藥組分分析中的新進展和應用。通過現(xiàn)狀描述和前景評估,闡明了本課題選題和研究的學術背景和技術意義。
　　 第二章主要研究和考察了色譜分析技術在中藥質(zhì)量控制中的應用,建立了納升級液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng),利用色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的靈敏性,用于中藥復雜體系的定性定量分析。此前,關于液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于中藥有效成分定性定量分析的報道較少,尤其是低濃度中藥的痕量物質(zhì)分析。以金銀花為例,我們首次使用納升色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(

5、nano-LC/MS)鑒定和定量中藥中的標準物質(zhì)。比較色譜保留時間和質(zhì)譜結構解析的信息,快速專一地確認金銀花中標準物質(zhì)綠原酸的定性信息;通過對綠原酸標準曲線的制作,建立綠原酸外標法的定量標準。作為分離前預處理方法的優(yōu)化,考察了不同提取方法,包括微波輔助萃取的新方法,常規(guī)提取方法,如回流萃取,超聲萃取等對金銀花中綠原酸的萃取效率。比較顯示微波輔助萃取能夠在較短時間內(nèi),即4分鐘之內(nèi),提供較好的提取效率。同時,液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)用于定性定量分析的有

6、效性和可靠性也經(jīng)過考察方法的線性、檢測限、準確性和回收率得到確認。結果顯示方法的線性范圍在0.8-20ng/mL,相關指數(shù)R2在0.991,檢測限為0.5ng/mL,標準偏差2.54％,回收率84.8％。Nano-LC/MS和微波輔助萃取的結合,綜合了兩者快速分析、減少樣品損耗、節(jié)約時間、降低試劑成本等優(yōu)點,可用于中藥標準物質(zhì)的定量和定性評估,尤其對于那些含量較少的痕量物質(zhì)更能體現(xiàn)其優(yōu)勢。
　　 第三章建立和優(yōu)化了離線的兩維色譜

7、系統(tǒng)用于中藥組分的分離,提高了色譜分離的峰容量和分辨力,解決了兩維間兼容性問題。首先將中藥千層塔在第一維色譜進行初步分離,這里選用分辨率相對較低的CN柱和甲醇/水流動相作為第一維。按照時間搜集各組流分后,再將這些流分通過第二維色譜進行進一步的細分。第二維色譜采用ODS和乙腈/水的反相色譜模式。為了考察這種色譜模式的有效性和兼容性,將不同提取時間和不同產(chǎn)地的千層塔作為目標物進行分離。不同的譜圖表現(xiàn)證實了這種離線兩維系統(tǒng)的高分辨能力。相對一

8、維色譜,兩維色譜系統(tǒng)能可靠地提供中藥更多的信息,為藥物的鑒定和后期的藥效藥理研究提供必要的分離基礎。
　　 第四章重點開發(fā)了以酶為藥物靶點的有效組分篩選系統(tǒng),利用酶的特異性結合和色譜、質(zhì)譜的高效分離鑒定能力快速有效地確認中藥組分中的有效成分,實現(xiàn)了有效成分確定、分離的嫁接。將糖尿病治療中的關鍵酶α-葡萄糖苷酶,通過乙醛基團與氨基基團的作用,借助戊二醛的螯合基團固定在氨基磁性納米微球上。固定化的酶用于底物的水解反應,通過高效液相色

9、譜考察產(chǎn)物產(chǎn)量的變化評估酶的催化活性。與傳統(tǒng)的生物檢測方法比較,這種預制備的固定化酶在活性的高低和系統(tǒng)穩(wěn)定性上都有更好的表現(xiàn),并且能夠簡單地重復利用10次左右。在確認固定酶的系統(tǒng)穩(wěn)定性前提下,將固定酶和色譜檢測結合的方式用于考察己知臨床藥物和幾味中藥對該酶的抑制作用。通過色譜檢測產(chǎn)物增加和減少,可以簡單直觀地評價固定酶的活性和抑制劑的抑制作用的強度。該方法通用于各類蛋白酶活性監(jiān)測,并且具有產(chǎn)物易分離,成本較低,試劑消耗更有效率的優(yōu)點。<

10、br>　　 此外,還選用了治療老年癡呆癥的關鍵活性酶,乙酰膽堿酯酶作為對象,考察磁性微米硅球固定酶的性能。乙酰膽堿酯酶固定于3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)修飾的磁性微米硅球上,與標準底物乙酰膽堿一起反應后,利用磁性將底物與產(chǎn)物快速分離。電噴霧質(zhì)譜作為快速定性和半定量方法用于測定產(chǎn)物量的變化,并以此作為酶活性的評價標準。比較同一組固定酶的5次重復酶促反應,沒有明顯的活性變動,固定酶的穩(wěn)定性得以確認。磁球固定的酶也

11、用于酶抑制劑的篩查,已知乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲和石杉堿乙,與固定酶一起參與酶促水解反應,酶活性的鈍化和產(chǎn)物離子峰的改變證明了固定酶和質(zhì)譜檢測在篩選酶抑制劑中的可行性和可靠性。
　　 另外,新型介孔材料FDU-12也用于制作固定酶的微酶反應器。介孔的三維立體有序排列促進了分子的擴散和運輸,從而形成了酶濃度增高和底物富集效應。酶反應器的有效應用為發(fā)展有效、生物兼容、多功能的納米反應器用于高通量多靶點藥物的篩選和研究提供了基礎。<

12、br>　　 第五章則拓展了多維色譜與生物技術的聯(lián)用,運用兩維色譜的高分辨分離和正交性,簡化中藥初篩步驟,降低篩選成本。結合酶模型、細胞模型的高特異選擇性,不僅可以發(fā)現(xiàn)中藥中的有效成分,而且還能從抑制酶活性和誘導細胞凋亡兩條路徑解釋中藥作用的機理。同時借助多孔板、自動流分收集器、酶標儀等現(xiàn)代自動化、產(chǎn)量化技術,建立中藥活性篩選的高通量模型。在酶分子水平上,我們選用了糖尿病代謝中的關鍵酶α-葡萄糖苷酶模型和離線兩維色譜結合,作為兩維色譜和

13、酶模型聯(lián)用的方法研究。首先建立和優(yōu)化離線兩維色譜分離黃芪中的各類組分,用于體外酶解實驗,初步確定有效區(qū)域。然后將有效區(qū)域通過色譜進一步分離,細分后的流分再通過體外酶試驗進一步確認更準確的有效物質(zhì)。最后將已經(jīng)確認的幾個有效物質(zhì)進行質(zhì)譜的結構解析,將這些結果與己知標準物進行對比,其中主要為已知的有效成分黃酮和異黃酮類。這是首次將兩維色譜與體外生物實驗結合篩查中藥中的有效成分,充分利用了兩維色譜的高分辨率和生物試驗的靈敏性。
　　 將

14、這種系統(tǒng)擴展到體外細胞模型上,利用兩維色譜分離黃連中的各個流分,然后將其與肝癌細胞一起培養(yǎng),通過觀察細胞的凋亡情況,找到促進肝癌細胞凋亡的有效物質(zhì)。從細胞水平上更有力地證明了兩維色譜分離系統(tǒng)在藥物開發(fā)和研究中的重要作用。
　　 簡言之,本論文的主要工作是考察了色譜/質(zhì)譜技術在質(zhì)量控制中的應用,建立了兩維色譜分離系統(tǒng),并首次將其與體外靶酶和細胞模型結合,篩查中藥中的有效組分。同時也合成了一些新型材料,固定糖尿病和老年癡呆的關鍵酶,