長(zhǎng)穗偃麥草和大米草全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與耐逆基因篩選.pdf

1、玉米是第一大糧食作物，能在不同的土壤條件和氣候條件下種植。我國(guó)0.67億公頃耕地中鹽漬化土壤約占10％，但是玉米的耐鹽能力比較低，當(dāng)鹽度大于17mmol·L-1時(shí)，50％以上的植物生長(zhǎng)受到抑制。鹽脅迫會(huì)引起玉米產(chǎn)量的降低。因此，研究玉米對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)及其耐鹽機(jī)制，對(duì)于玉米耐鹽性改良具有非常重要的意義。然而，作為淡土植物的玉米，其耐鹽機(jī)制非常復(fù)雜，耐鹽性狀常表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。采用常規(guī)育種或分子育種手段提高玉米耐鹽性收效甚微。

2、通過(guò)外源基因漸滲或轉(zhuǎn)基因途徑，利用野生耐鹽植物基因資源創(chuàng)制耐鹽玉米種質(zhì)是提高玉米耐鹽性的關(guān)鍵。目前，已有通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑提高玉米耐鹽性的報(bào)道。耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育的一般做法是根據(jù)人們對(duì)植物耐鹽機(jī)制的認(rèn)識(shí)，挑選少數(shù)被認(rèn)為與耐鹽相關(guān)的基因進(jìn)行操作，需要花費(fèi)多年時(shí)間才能獲得轉(zhuǎn)基因植株，并且經(jīng)常出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)性狀表現(xiàn)不明顯，甚至與預(yù)期結(jié)果不一致的現(xiàn)象。這種做法的缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)、效率低，不能突破現(xiàn)有知識(shí)的框架。為了快速、高效篩選、應(yīng)用野生植物中的耐

3、鹽基因資源，本試驗(yàn)選擇耐鹽性較強(qiáng)的淡土植物—長(zhǎng)穗偃麥草(Lophopyrum elongatum L.)和耐鹽性超強(qiáng)的鹽生C4植物——大米草(Spartina anglica Hubb)為材料，提取了不同濃度的NaCl和PEG-6000、不同處理時(shí)間下的幼苗RNA并等量混合。采用改良的SMART技術(shù)合成雙鏈cDNA后，用Gateway方法將cDNA文庫(kù)重組到植物轉(zhuǎn)基因雙元載體pMDC83，并將長(zhǎng)穗偃麥草和大米草cDNA文庫(kù)分別導(dǎo)入玉米或

4、煙草BY-2細(xì)胞中，初步建立了快速篩選并挖掘植物耐鹽基因的技術(shù)平臺(tái)。主要結(jié)果如下:
　　分別以100、200、300、400mmol·L-1的NaCl和20％、30％、50％(w/v)的PEG-6000處理長(zhǎng)穗偃麥草幼苗ld、3d、5d、7d，用5％(w/v) NaCl處理大米草幼苗1d、3d、5d、7d，分別提取RNA后等量混合為總RNA。采用改良的SMART(switchingmechanism at5'end of RNA

5、transcript)方法合成全長(zhǎng)cDNA后，用Gateway技術(shù)中的BP反應(yīng)構(gòu)建了長(zhǎng)穗偃麥草和大米草全長(zhǎng)入門cDNA文庫(kù)，滴度分別為4.0×106cfu·mL-1和4.3×106cfu·mL-1，重組率均達(dá)98％以上。再采用LR反應(yīng)，分別將兩個(gè)入門文庫(kù)重組到植物轉(zhuǎn)基因雙元載體pMDC83中，獲得目標(biāo)文庫(kù)。長(zhǎng)穗偃麥草和大米草的目標(biāo)文庫(kù)原始滴度為6.0×106cfu·mL-1和5.7×106cfu·mL-1，插入片段平均長(zhǎng)度均為0.45k

6、b，重組率均達(dá)100％。從兩個(gè)目標(biāo)文庫(kù)中各隨機(jī)挑取5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASTX比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)長(zhǎng)穗偃麥草陽(yáng)性克隆的插入片段分別與植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞壁水解酶、衰老相關(guān)蛋白等有較高程度的相似性，但是其余7個(gè)序列未比對(duì)到相似序列。
　　采用本實(shí)驗(yàn)室建立的農(nóng)桿菌侵染萌發(fā)花粉再授粉的方法，將長(zhǎng)穗偃麥草和大米草cDNA目標(biāo)文庫(kù)導(dǎo)入玉米，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米T0代種子。通過(guò)對(duì)T0代玉米種子的GFP熒光信號(hào)

7、的觀察、潮霉素抗性檢測(cè)和PCR驗(yàn)證，證明外源基因成功導(dǎo)入玉米。
　　用農(nóng)桿菌侵染法將農(nóng)桿菌與煙草BY-2細(xì)胞共培養(yǎng)，將長(zhǎng)穗偃麥草目標(biāo)文庫(kù)轉(zhuǎn)入煙草BY-2細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入25mg·L-1潮霉素和濃度分別為50mmol·L-1、100mmol·L-1和200mmol·L-1的NaCl對(duì)其進(jìn)行篩選，在50mmol·L-1、100mmol·L-1的鹽濃度下初步獲得耐鹽細(xì)胞系169個(gè)，而200mmol·L-1 NaCl的鹽濃度下沒(méi)有發(fā)