人汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的關(guān)鍵因素及作用機(jī)制.pdf

1、我國每年有上千萬燒傷病人，其中輕度燒傷的患者尚可通過其深層未受創(chuàng)部分為模板進(jìn)行皮膚修復(fù)，但深度燒傷的病人，汗腺不能通過皮下剩余正常的組織向上進(jìn)行后期修復(fù)，嚴(yán)重影響了燒傷患者的生活質(zhì)量。因此汗腺細(xì)胞應(yīng)用于組織工程皮膚構(gòu)建和皮膚損傷修復(fù)的研究已成為熱點(diǎn)。汗腺細(xì)胞生物學(xué)特征和汗腺再生研究啟步較晚,近年來針對如何有效促進(jìn)汗腺細(xì)胞體外增殖，維持汗腺細(xì)胞生物學(xué)特征和功能的研究還在探索中。目前國際上用于培養(yǎng)汗腺細(xì)胞的培養(yǎng)基分為有血清和無血清兩類培養(yǎng)基

2、，但其擴(kuò)增和傳代及培養(yǎng)體系尚不完善。本文旨在比較不同培養(yǎng)基對于維持汗腺細(xì)胞生物學(xué)特征和增殖能力的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索血清和音猬基因（Sonic Hedgehog）在汗腺體外培養(yǎng)條件中的作用和機(jī)制，進(jìn)而優(yōu)化人汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件。
　　第一部分血清在人汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)條件中的作用和機(jī)制
　　目的:比較含血清和無血清培養(yǎng)基對汗腺細(xì)胞生物學(xué)特征和功能的影響，并探討血清在汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基中的作用和機(jī)制。
　　方法:利用手術(shù)廢棄的

3、六指全層皮膚，去除表皮后，在倒置顯微鏡下分離出汗腺組織，并將其培養(yǎng)在含血清的 SG培養(yǎng)基中（DMEM/F12+10％FBS，hEGF，Hydrocortison，Triiodothyronine，Insulin-Transferrin-selenium)。約一周后，待汗腺細(xì)胞向外增殖，將增殖的汗腺細(xì)胞分別培養(yǎng)在 SG培養(yǎng)基，KGM-2培養(yǎng)基(KBM-2，BPE，insulin，hydrocortisone，transferrin，epi

4、nephrine，GA-100)和SG:KGM-2為1：1的混合培養(yǎng)基中。通過細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖，Real-time PCR、體外三維培養(yǎng)等檢測方法對三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:（1）汗腺細(xì)胞在三種不同培養(yǎng)基中比較性地培養(yǎng)一周后，混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞呈更高的增殖率及更穩(wěn)定的細(xì)胞形態(tài)；（2）Real-time PCR結(jié)果顯示，混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞所表達(dá)的標(biāo)志基因（SMA，K77，CEA

5、，K8，K18，EDAR，C-MYC，Klf-4，OCT-4）都高于SG培養(yǎng)基和KGM-2培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞，并經(jīng)三維培養(yǎng)，能形成類似汗腺腺體的結(jié)構(gòu)；（3）KGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)K5,K14等角質(zhì)化細(xì)胞標(biāo)志基因，并能形成成熟的上皮組織。上述研究表明，含血清的培養(yǎng)基有利于汗腺細(xì)胞體外增殖和生物學(xué)特征的維持，而無血清的KGM-2培養(yǎng)基使汗腺細(xì)胞失去其生物學(xué)特征和功能的原因是，無血清培養(yǎng)體系中汗腺細(xì)胞會快速分化為角質(zhì)化細(xì)胞。<

6、br>　　結(jié)論：本研究建立的混合培養(yǎng)基，不僅能有效提高汗腺細(xì)胞體外增殖能力，還能更好地維持汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能。
　　第二部分 Sonic Hedgehog對體外培養(yǎng)汗腺細(xì)胞生物學(xué)特征和功能的作用
　　目的:探討音猬基因（Sonic Hedgehog）即Shh在汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)中的作用，進(jìn)一步優(yōu)化目前的汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
　　方法:利用手術(shù)廢棄的六指全層皮膚，去除表皮后，在倒置顯微鏡下分離出汗腺組織，并將其培

7、養(yǎng)在含血清的 SG培養(yǎng)基中（DMEM/F12+10%FBS，hEGF，Hydrocortison，Triiodothyronine，Insulin-Transferrin-selenium)。約一周后，待汗腺細(xì)胞向外增殖，將增殖的汗腺細(xì)胞分別培養(yǎng)在第一部分中的混合培養(yǎng)基和添加 Shh因子的混合培養(yǎng)基中。通過細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、Real-time PCR、體外三維培養(yǎng)等檢測方法對兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能進(jìn)行鑒定。

8、　　結(jié)果:（1）汗腺細(xì)胞在兩種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后，添加有Shh混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞同樣呈汗腺細(xì)胞樣形態(tài)，且其生長速率與未添加 Shh的混合培養(yǎng)基相近；（2）Real-time PCR結(jié)果顯示，添加有Shh混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞所表達(dá)的標(biāo)志基因（SMA，K77，CEA，K8，K18，EDAR，C-MYC，KLF-4，OCT-4）相比混合培養(yǎng)基所培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞有顯著提高，并與原代汗腺細(xì)胞接近；（3）經(jīng)三維培養(yǎng)，添加有Shh混合培養(yǎng)

9、基中的汗腺細(xì)胞形成汗腺樣腺體的結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯多于未添加Shh的混合培養(yǎng)基。
　　結(jié)論：在混合培養(yǎng)基中添加Shh可以更有效地維持汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能，在體外三維組織培養(yǎng)中形成更多的汗腺樣結(jié)構(gòu)。
　　總結(jié)
　　本研究通過對人汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基的比較，證明了混合培養(yǎng)基更適用于培養(yǎng)汗腺細(xì)胞，其中血清是維持汗腺細(xì)胞生物學(xué)特征的關(guān)鍵因素。在此基礎(chǔ)上，我們在混合培養(yǎng)基中添加了Shh因子，證明了添加Shh因子可以提高汗腺細(xì)胞在體外三