低濃度血清法培養(yǎng)純化新生大鼠雪旺細(xì)胞.pdf

1、雪旺細(xì)胞(Schwann cell，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的膠質(zhì)細(xì)胞，能夠形成有髓和無(wú)髓神經(jīng)纖維的神經(jīng)內(nèi)膜組織，具有多種的生理學(xué)功能，增生的雪旺細(xì)胞能夠產(chǎn)生和分泌多種的能夠促進(jìn)神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生修復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞粘附分子等。在神經(jīng)的再生過(guò)程中，雪旺細(xì)胞可以通過(guò)吞噬變性的軸突和髓鞘碎屑、分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（包括NGF，BDNF等）、分泌層粘連蛋白等多種基底膜成份等途徑，為近端軸突的再生提供一個(gè)良好的再生微環(huán)境，引導(dǎo)軸突再生

2、。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，在能夠構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管的支架材料上種植雪旺細(xì)胞，移植人體可以促進(jìn)軸突的快速生長(zhǎng)，進(jìn)一步的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，但是如何能夠快速與大量的獲得純度高、狀態(tài)好的雪旺細(xì)胞是移植成功與否的關(guān)鍵。
　　 目的：1．探討分離，培養(yǎng)，SD大鼠雪旺細(xì)胞的方法。2．利用低濃度血清培養(yǎng)基純化體外培養(yǎng)的新生大鼠的雪旺細(xì)胞。3．觀察和檢測(cè)低濃度血清處理后的雪旺細(xì)胞生物學(xué)性狀和神經(jīng)因子分泌能力的影響。
　　 方法：1．取新生3-7日的

3、SD大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，顯微鏡下將神經(jīng)剪碎至1mm3左右大小的神經(jīng)碎塊，利用雙酶消化法分離培養(yǎng)，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。6天后分別以含有胎牛血清濃度為10％、2%及無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基處理原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞6天后，終止培養(yǎng)，并收集細(xì)胞。2．分別取原代培養(yǎng)及處理過(guò)后的雪旺細(xì)胞，采用免疫組化技術(shù)：以SABC方法標(biāo)記雷旺細(xì)胞的特異性標(biāo)記性蛋白S100，并在200倍顯微視野下以細(xì)胞計(jì)數(shù)方式分別統(tǒng)計(jì)雪旺細(xì)胞及成纖維細(xì)胞數(shù)，從而得到雪旺細(xì)胞的

4、純度即雪旺細(xì)胞數(shù)/雪旺細(xì)胞＋成纖維細(xì)胞數(shù)，獲得數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增值比率：在終止細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，以0.25%胰酶消化細(xì)胞，并以70%無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析得到S期、G2期的比率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；利用RT-PCR法NGF、BDNF的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況：在終止處理后，以Trizol提取液方法提取細(xì)胞的總RNA以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)做內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，利用反轉(zhuǎn)錄一多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)A組和

5、B組的NGF、BDNF的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)量其灰度值，分別計(jì)算NGF、BDNF和內(nèi)標(biāo)基因(β-actin)PCR產(chǎn)物的灰度比值半定量和NGF、BDNF;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：1．以2%濃度血清DMEM培養(yǎng)基分離培養(yǎng)純化后，雪旺細(xì)胞的狀態(tài)好，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析表明其純度達(dá)到96.9%以上。2．處理后的細(xì)胞S100蛋白表達(dá)穩(wěn)定，各組之間的細(xì)胞周期S期、