異丙酚對鼠發(fā)育中大腦神經(jīng)干細胞增殖與凋亡的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、每年全世界有成千上萬的嬰幼兒接受外科手術(shù)、有創(chuàng)性治療或一些需要麻醉輔助的影像學檢查,這些嬰幼兒需要接受各種麻醉藥和鎮(zhèn)靜藥的輔助治療,因此,研究麻醉藥對發(fā)育中大腦的影響具有重要的臨床意義。研究顯示臨床上使用麻醉藥對發(fā)育中的哺乳動物大腦有潛在危害,在大腦快速發(fā)育期,也就是突觸形成期,給予麻醉藥會引起哺乳動物大腦敏感區(qū)域神經(jīng)凋亡,尤其是在出生后第七天鼠,對麻醉藥的凋亡作用非常敏感。越來越多數(shù)據(jù)表明麻醉藥包括異氟醚、氯胺酮、NO、咪唑安定、硫噴

2、妥納、異丙酚、七氟醚對發(fā)育中大腦有毒性作用并且能引起長時期認知功能障礙。神經(jīng)毒性的嚴重程度與劑量和暴露的時間有關(guān),并且復合麻醉后加重,其機制涉及GABA、甘氨酸、谷氨酸、尼古丁等多個受體和相關(guān)的通路,但是其具體的分子機制并未明確。
　　 異丙酚(Propofol)是一種新型的短效靜脈麻醉藥物,80年代中期開始應(yīng)用于臨床。1989年美國FDA通過并推薦臨床使用,目前被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于臨床麻醉誘導、維持及ICU鎮(zhèn)靜。隨著臨床的廣泛應(yīng)

3、用,人們發(fā)現(xiàn)異丙酚有其獨特的優(yōu)點:起效快,麻醉狀態(tài)可控性強,維持時間短,蘇醒迅速,無積蓄,副作用小等,在產(chǎn)科和兒科手術(shù)也逐漸被推廣使用,目前臨床上輸注異丙酚是否會導致學習、記憶障礙或者發(fā)育延遲還沒有報道,但已經(jīng)有動物研究表明異丙酚對發(fā)育中大腦神經(jīng)有促凋亡作用,長時間使用異丙酚會導致神經(jīng)細胞凋亡數(shù)明顯增加,并且成年后學習能力缺失,然而異丙酚引起神經(jīng)凋亡與神經(jīng)功能損害的機制目前還不清楚。
　　 為了探索異丙酚引起細胞凋亡的機制,有學

4、者研究了異丙酚及GABA-A調(diào)節(jié)劑對細胞內(nèi)鈣離子及海馬神經(jīng)細胞早期及延遲細胞死亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)出生后第四天海馬神經(jīng)細胞暴露于5umol/L異丙酚5個小時引起細胞去極化,細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,Caspase激活,促進細胞死亡,使用GABA-A受體阻斷劑荷包牡丹堿或者鈣通道阻斷劑引起細胞內(nèi)鈣離子濃度降低,抑制細胞死亡,細胞內(nèi)鈣離子濃度升高是細胞凋亡的必要條件,但使用GABA-A激動劑蠅蕈醇雖然引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,但沒有出現(xiàn)細

5、胞死亡,因此鈣離子濃度升高不能完全解釋異丙酚引起的細胞凋亡。細胞凋亡主要通過內(nèi)源性或者外源性途徑。內(nèi)源性途徑通過下調(diào)抗凋亡bcl-2蛋白家族,比如bcl-xL,增加細胞線粒體通透性,使細胞色素C釋放,激活caspase-9和caspase-3,導致凋亡損害。外源性通路由死亡受體激活,形成死亡受體復合物,包含F(xiàn)as、TNF-α超家族,死亡受體復合物激活caspase-8,最后激活caspase-3,誘導凋亡,那么異丙酚引起細胞凋亡的原因是

6、什么,它是通過何種凋亡途徑引起的,基于此,我們體外培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)干細胞,用Brdu法觀察了異丙酚對胚胎神經(jīng)干細胞增殖的影響,采用細胞流式技術(shù)觀察了不同濃度異丙酚對細胞凋亡的影響,同時提取蛋白通過westernblot檢測細胞凋亡通路上的幾個關(guān)鍵蛋白細胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9,從而探討異丙酚引起神經(jīng)細胞凋亡通路,為尋找相應(yīng)的靶點,阻斷細胞凋亡通路,減輕異丙酚神經(jīng)毒性作用打下基礎(chǔ)。
　　

7、 已經(jīng)有研究表明干預GABA受體和NMDA受體可以引起神經(jīng)增殖改變,而麻醉藥的作用受體主要為GABA受體和NMDA受體。因此,麻醉藥對發(fā)育中大腦毒性反應(yīng)除引起凋亡外,也可能對神經(jīng)增殖產(chǎn)生影響。Stratmann等證實7日齡使用3.5％異氟醚,發(fā)現(xiàn)齒狀回神經(jīng)增殖減少至少持續(xù)4天以上,并導致永久的神經(jīng)功能損害,而這種現(xiàn)象并沒有在出生60天幼鼠發(fā)生。異丙酚作為臨床上常用的靜脈全麻藥,除了對發(fā)育中大腦神經(jīng)有促凋亡作用,那么對于發(fā)育中大腦神經(jīng)增殖

8、有沒影響呢?近來,許多學者對海馬齒狀回神經(jīng)干細胞及其子代細胞生成早期(前4周)的神經(jīng)元電生理特性進行了研究,發(fā)現(xiàn)前體細胞在早期尚未具備自發(fā)性或者誘發(fā)突觸后電位之前即被GABA激動,并可進一步激活局部神經(jīng)元之間的GABA電流。在前體細胞分化為粒狀神經(jīng)元后,新生細胞開始接受突觸GABA內(nèi)向電流,一周后開始接受谷氨酸內(nèi)向電流。Ge等采用shRNA下調(diào)新生神經(jīng)元的Na+-K+-2CL-轉(zhuǎn)運體,發(fā)現(xiàn)GABA介導的突觸聯(lián)系的形成,并且會損害新生神經(jīng)

9、元樹突的發(fā)育,提示GABA介導的去極化對于新生神經(jīng)元的成熟和功能具有重要的作用。在突觸形成期給于麻醉藥不僅影響神經(jīng)前體細胞增殖,還影響存活和整合到回路中,而異丙酚作用靶點主要為GABA受體,因此,也將可能對神經(jīng)前體細胞的增殖和發(fā)育產(chǎn)生影響。側(cè)腦室下帶和海馬齒狀回是神經(jīng)發(fā)生的兩個重要區(qū)域,對學習和記憶有著重要的功能,異丙酚對海馬齒狀回神經(jīng)增殖產(chǎn)生影響也可能影響成年后認知功能。
　　 體內(nèi)外的研究結(jié)果提示,神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、EG

10、F和bFGF能夠促進神經(jīng)元的再生。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的重要一員,主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、基底前腦、紋狀體等膽堿能神經(jīng)元中。研究表明,BDNF不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元的生存、分化、生長和維持神經(jīng)元正常的生理功能起關(guān)鍵作用,而且還可以通過前膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)對學習記憶發(fā)揮作用,并且可以調(diào)節(jié)突觸傳遞易化。BDNF的營養(yǎng)神經(jīng)和促進軸突生長的作用是通過與其特異性的高親和力受體TrkB結(jié)合而發(fā)揮的。有研究報道全麻抑制神經(jīng)存活及軸突發(fā)

11、育所需的神經(jīng)營養(yǎng)因子,比如腦源性營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)。米衛(wèi)東等報道腹腔注射50mg/kg以上劑量異丙酚對缺血性腦損傷沙土鼠海馬神經(jīng)元增殖有抑制作用,可能的原因為減少BDNF及作用受體TrkB蛋白含量有關(guān)。
　　 那么異丙酚作為臨床上常用的靜脈全麻藥,對發(fā)育中大腦神經(jīng)增殖有沒影響呢?如果有影響,那么是增強還是抑制?與劑量、時間有無關(guān)系?影響的作用機制是怎樣?對成年后學習、記憶能力

12、有沒影響?基于此,本研究選用出生后7天的wistar幼鼠,分單次或者重復注射異丙酚,用Brdu染色觀察對海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響,同時檢測與神經(jīng)干細胞存活有關(guān)蛋白BDNF的表達,探討可能的機制,用Morris水迷宮實驗觀察異丙酚重復鎮(zhèn)靜對成年后大鼠空間學習能力的影響,進一步明確成年后行為功能與增殖之間的關(guān)系,進一步探討異丙酚在產(chǎn)科和兒科手術(shù)使用的安全性,從而更好的指導其在嬰幼兒中的運用。
　　 第1部分異丙酚對鼠發(fā)育中大腦神經(jīng)干

13、細胞增殖及幼鼠成年后空間學習記憶能力的影響
　　 1.方法:
　　 1.1.異丙酚麻醉ED95測定
　　 選擇7日齡wister幼鼠,隨機分為40、60、80、100mg/kg異丙酚劑量組。腹腔注射5分鐘后測甩尾反射,然后在各組異丙酚劑量的對數(shù)值與甩尾反射陰性率之間建立回歸方程,根據(jù)概率單位法計算異丙酚使95％實驗幼鼠對傷害性刺激無甩尾反射所需異丙酚劑量即ED95。
　　 1.2.血氣分析
　　

14、為了排除缺血、缺氧引起的神經(jīng)細胞損害,選擇20只7日齡幼鼠,分為異丙酚組與對照組,每組10只,分別測定異丙酚100mg/kg處理組與對照組的動脈血氣,檢測PH、PCO2、HCO3-、PO2。
　　 1.3.單次異丙酚給藥對神經(jīng)干細胞增殖的影響
　　 將同窩出生的7日齡幼鼠40只隨機分為數(shù)量平均的四組,每組10只。各組分別腹腔注射生理鹽水10ml/kg、脂肪乳劑10ml/kg、異丙酚50mg/kg、異丙酚100mg/kg,

15、然后腹腔注射300mg/kg Brdu,12h后灌注切腦片做Brdu免疫組化。
　　 1.4.重復異丙酚給藥對神經(jīng)干細胞增殖的影響
　　 將同窩出生的7日齡幼鼠64只隨機分為數(shù)量平均的四組,每組16只。各組分別腹腔注射生理鹽水10ml/kg、脂肪乳劑10ml/kg、異丙酚50mg/kg、異丙酚100mg/kg,連續(xù)注射7天,第7天腹腔注射300mg/kg Brdu,12h后每組取10只灌注切腦片做Brdu免疫組化,6只取

16、海馬提蛋白westerblot檢測BDNF。
　　 1.5.重復異丙酚給藥對成年后學習記憶的影響
　　 將同窩出生的7日齡幼鼠20只隨機分為生理鹽水組10ml/kg、異丙酚100mg/kg兩組,每組10只。各組均為腹腔注射,連續(xù)注射7天,麻醉蘇醒后放回母鼠飼養(yǎng),飼養(yǎng)兩月成年后行Morris水迷宮實驗觀察其空間學習和記憶能力。
　　 2.結(jié)果:
　　 2.1異丙酚麻醉劑量ED95
　　 各組幼鼠給藥

17、后鼻唇,趾端膚色紅潤,無發(fā)紺,呼吸頻率稍偏慢。在各組異丙酚的對數(shù)劑量(Y)與甩尾反射陰性率相對的概率單位(X)間建立直線回歸方程:Y=0.103x+1.292,查反對數(shù)表得到使95％甩尾反射陰性率的異丙酚劑量為:94.48mg/kg,幼鼠異丙酚麻醉劑量ED95為94.48mg/kg。
　　 2.2血氣分析結(jié)果
　　 異丙酚組血氣分析結(jié)果與對照組沒有顯著差異,其中異丙酚處理后PH略有下降,但沒有統(tǒng)計學意義(t=1.622,

18、P=0.122)；PO2在兩組間比較沒有顯著差異(t=1.541,P=0.141)；PCO2在異丙酚處理后稍升高,但沒有統(tǒng)計學意義(t=-1.397,P=0.179)；兩組間的HCO3-沒有顯著差異(t=-1.510,P=0.148)。
　　 2.3異丙酚單次注射后對鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)BrdU陽性細胞的影響
　　 各組新生鼠的海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見一些分布不均勻,形狀不規(guī)則的BrdU染色陽性的棕色顆粒,這些棕色顆粒即

19、為新生的神經(jīng)元前體細胞。四組之間BrdU染色陽性細胞數(shù)沒有顯著差異(F=1.009,P=0.391)。
　　 2.4異丙酚重復注射后對鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)BrdU陽性細胞的影響
　　 各組新生鼠的海馬齒狀回均可見一些分布不均勻,形狀不規(guī)則的BrdU染色陽性的棕色顆粒,這些棕色顆粒即為新生的神經(jīng)元前體細胞,四組Brdu陽性細胞數(shù)有顯著差異(F=250.84,P=0.000),其中對照組與脂肪乳劑組沒有差異(P=0.380)

20、,與對照組相比,異丙酚處理組Brdu陽性細胞數(shù)有顯著差異(p=0.000),其中異丙酚100mg/kg組Brdu陽性細胞數(shù)又明顯少于異丙酚50mg/kg組(p=0.000)。
　　 2.5 Morris水迷宮結(jié)果
　　 分別比較對照組和異丙酚組大鼠的逃逸潛伏期及平臺象限游泳時間占總游泳時間比值,水迷宮訓練2天后即第三天大鼠逃避潛伏期縮短,但兩組逃逸潛伏期開始出現(xiàn)顯著差異(P=0.000),與對照組相比,異丙酚100mg/

21、kg組潛伏期延長。在第五天空間搜索能力測試中,異丙酚組在平臺象限游泳時間占總游泳時間比值明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 2.6異丙酚重復注射后對大鼠海馬BDNF蛋白含量的影響
　　 為了檢測重復注射異丙酚對海馬BDNF蛋白含量的影響,應(yīng)用免疫印跡法檢測BDNF。以BDNF條帶灰度數(shù)值比β-actin條帶灰度數(shù)值所得百分數(shù)為結(jié)果數(shù)值。方差分析結(jié)果顯示各組間均數(shù)存在顯著性差異(F=50.958,P

22、=0.000),對照組與脂肪乳劑組BDNF含量最高,兩組相比沒有統(tǒng)計學差異(P=0.538),與對照組相比,異丙酚組含量明顯減少(p=0.000),其中100mg/kg異丙酚組含量又明顯少于50mg/kg異丙酚組(P=0.007)。
　　 3.結(jié)論:
　　 1)異丙酚麻醉新生鼠的ED95為94.48mg/kg。腹腔注射100mg/kg異丙酚麻醉后與麻醉前動脈血氣無顯著差異。
　　 2)與對照組相比,異丙酚單次給藥

23、后海馬齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)無顯著差異,但重復給藥7天后海馬齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)則顯著減少(P<0.05)。
　　 3)成年后Morris水迷宮測試顯示,異丙酚組幼鼠從第三天逃逸潛伏期顯著高于對照組(P<0.05),而平臺像限游泳時間占總游泳時間百分數(shù)則顯著短于對照組(P<0.05)。
　　 4)反復注射異丙酚組的BDNF蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)。
　　 第2部分異丙酚對鼠胚胎神經(jīng)干細胞凋亡

24、影響及作用機制研究
　　 1.方法:
　　 選擇孕14-16d Wistar大鼠,分離培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞,取第2代神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)24 h后進行神經(jīng)干細胞標記蛋白Nestin免疫熒光法染色鑒定,分別用5,25,50和100μmol/L的異丙酚進行處理,并同時設(shè)立脂肪乳劑組和空白對照組,添加Brdu培養(yǎng)24h后采用免疫組化法標記BrdU陽性細胞,DAPI復染細胞核；采用MTT法檢測細胞存活率；流式細胞術(shù)觀察異丙酚對胚胎神經(jīng)干

25、凋亡的影響；然后提取對照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時后的全細胞蛋白,用Western—blot檢測激活的細胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達。數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析,P值<0.05認為存在統(tǒng)計學差異。
　　 2.結(jié)果:
　　 2.1胚胎神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　 胚胎神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)后第二天長

26、成大小不一的神經(jīng)球,懸浮在培養(yǎng)液中,傳代后神經(jīng)球生長速度逐漸減慢。取第2代神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)24 h后進行神經(jīng)干細胞標記蛋白Nestin免疫熒光法染色,將同一個培養(yǎng)皿中總細胞和陽性細胞計數(shù)后計算百分比作為該次實驗結(jié)果。Nestin陽性的培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞占所有培養(yǎng)細胞的比例維持在90.36～93.90％。
　　 2.2異丙酚對胚胎神經(jīng)干細胞增殖的影響
　　 空白對照組、脂肪乳劑組、5、25、50和100μmol/L異丙酚處理組

27、的細胞進行BrdU的摻入和免疫細胞熒光檢測,每次實驗將48孔板的5個復孔中分別隨機取兩個視野的所有陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)相比后得到的百分比數(shù)作為該組的實驗結(jié)果,統(tǒng)計結(jié)果顯示各組間不存在顯著性差異(F=0.462,P=0.802),LSD法多重比較結(jié)果顯示異丙酚處理組間沒有差異,并不隨濃度改變而改變。
　　 2.3 MTT結(jié)果
　　 每次實驗將96孔板的5個復孔中每個孔的MTT檢測數(shù)值與對照組所有MTT值的平均值相比后得到的

28、百分比數(shù),即標準化值作為該孔的實驗結(jié)果。培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞數(shù)在處理后各組間存在顯著性差異(F=3.584,P=0.015),LSD多重比較結(jié)果顯示空白對照組和脂肪乳劑組無顯著性差異,5-100μmol/L異丙酚處理24小時后細胞存活率下降,隨濃度升高而下降。
　　 2.4流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果
　　 培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞凋亡率各組間存在顯著性差異(F=247.733,P=0.000),空白對照組和脂肪乳劑處理12小時后

29、凋亡率無顯著性差異(P=0.900),但與異丙酚組有顯著差異(P=0.000),異丙酚處理組細胞凋亡率隨濃度升高逐漸升高,到50μmol/L濃度時達到最高峰,100μmol/L時細胞死亡率超過凋亡率。添加了caspase抑制劑的50μmol/L屏丙酚凋亡率顯著少于50μmol/L屏丙酚(P=0.000)。
　　 2.5異丙酚對胚胎神經(jīng)干細胞凋亡通路上關(guān)鍵蛋白的影響
　　 1)異丙酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞caspase-

30、3水平
　　 空白對照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時后提取蛋白做激活的caspase-3免疫印跡,方差檢驗結(jié)果顯示組間均數(shù)存在顯著性差異(F=47.495,P=0.000),50μmol/L屏丙酚組caspase-3條帶灰度值顯著高于脂乳劑組與空白對照組(P=0.000),添加抑制劑后激活的caspase-3含量顯著降低(P=0.000)。
　　 2)異丙

31、酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞Cytochrome C水平
　　 空白對照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時后提取蛋白做Cytochrome C免疫印跡,方差檢驗結(jié)果顯示Cytochrome C含量組間存在顯著性差異(F=114.717,P=0.000),50μg/mL異丙酚提高了Cytochrome C的水平,灰度值顯著高于脂肪乳劑組與空白對照組(P=0.000),但添

32、加抑制劑后Cytochrome C的含量減低,與未添加組相比有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 3)異丙酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞caspase-9水平
　　 空白對照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時后提取蛋白做激活的caspase-9免疫印跡。條帶灰度值分析結(jié)果顯示組間均數(shù)存在顯著性差異(F=135.975,P=0.000),與脂肪乳劑組與空白對照組相

33、比,50μg/mL異丙酚組caspase-9表達水平顯著提高(P=0.000),添加抑制劑后激活的caspase-9的表達水平下降(P=0.000)。
　　 4)異丙酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞caspase-8水平
　　 空白對照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時后提取蛋白做激活的caspase-8免疫印跡。方差檢驗結(jié)果顯示組間均數(shù)存在顯著性差異(F=9.22

34、5,P=0.006),脂肪乳劑組caspase-8表達水平高于對照組(P=0.025),異丙酚提高了caspase-8的水平,灰度值明顯高于脂肪乳劑組與空白對照組(P>0.05),添加抑制劑后caspase-8的激活水平比未添加抑制劑異丙酚組顯著降低(P=0.009)。
　　 3.結(jié)論:
　　 1)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細胞Nestin陽性比例維持在90.36～93.90％。
　　 2)不同濃度異丙酚對胚胎神經(jīng)干細胞增

35、殖沒有影響,但能降低細胞的存活率,其效應(yīng)呈劑量依賴型。
　　 3)異丙酚能引起胚胎神經(jīng)干細胞凋亡,其效應(yīng)呈劑量依賴型,100μmol/L異丙酚處理后細胞死亡率大于凋亡率。
　　 4)異丙酚處理后的胚胎神經(jīng)干細胞激活的caspase-3、CytochromeC、caspase-9 caspase-8蛋白表達水平顯著增加。
　　 總結(jié):
　　 本研究分別以培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細胞和出生后7日齡新生鼠為模型,觀察了