通心絡(luò)對缺血再灌注鼠腦神經(jīng)干細胞增殖分化的作用及機理研究.pdf

1、腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，與惡性腫瘤、心臟病一起構(gòu)成人類的三大致死性疾病，其死亡率占全部疾病的10％，僅次于腫瘤，是目前人類三大疾病死亡原因之一，存活者中50％-70％遺留有癱瘓、失語等嚴重后遺癥，不僅給患者本人帶來極大的痛苦，也給社會和家庭帶來沉重的負擔。在我國進行的大規(guī)模人群調(diào)查顯示，腦卒中的年發(fā)病率為109.7-217/10萬，患病率為719-745.6/10萬，死亡率116-141.8/10萬，男女發(fā)病比例為1.3-1

2、.7：1。我國每年新發(fā)病例超過150萬，死亡人數(shù)達100萬，總患病人數(shù)在600萬以上，其中約3/4的幸存者留有不同程度的后遺癥，重度致殘者在40％以上。 因此，腦血管病的研究具有十分重大的現(xiàn)實意義，也是目前神經(jīng)科學(xué)的研究焦點；尤其對于以腦梗死為代表的發(fā)病率高后遺癥多的缺血性腦卒中的治療研究方興未艾。 本實驗在實驗室前期研究基礎(chǔ)上，利用改良的大鼠腦缺血再灌注模型研究通心絡(luò)治療缺血再灌注損傷的機制，探討在通心絡(luò)治療作用下，大

3、鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，以及腦組織神經(jīng)干細胞的增殖和分化改變，相關(guān)細胞因子的變化，為缺血性腦卒中的治療提供實驗基礎(chǔ)。 進行缺血性腦卒中的實驗研究，建立生理指標控制嚴格、重復(fù)性好和結(jié)果可靠的活體動物模型十分重要。目前，大鼠局灶性腦缺血模型的制造方法有多種，每一種方法都有其各自的特點和優(yōu)勢，同時又有一定的局限性。本實驗結(jié)合前人的研究成果，在實驗室前期研究基礎(chǔ)上，對線栓法大鼠缺血腦梗死再灌注模型進行改良，建立了一種新的模型制作方法，該方法具

4、有操作簡便，易于推廣，模型成功率高，死亡率低的優(yōu)點，為今后的腦缺血實驗研究提供理想的模型動物。 目前，缺血性腦血管病的治療主要以超早期溶栓和神經(jīng)保護為主，目的在于恢復(fù)缺血區(qū)腦組織的血液供應(yīng)，保護微血管、神經(jīng)元，促進毛細胞血管再生，側(cè)枝循環(huán)的重建，神經(jīng)結(jié)構(gòu)重塑等方面。但是，作為一種共識，神經(jīng)功能的重建恢復(fù)仍是腦缺血治療的難題。由于神經(jīng)組織是分裂期后終末分化組織，過去認為損傷后不能再生。但近年來研究隨著干細胞的發(fā)現(xiàn)，證明腦組織有自我

5、修復(fù)的潛能，腦組織的可塑性成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個重要特征。神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSC)作為神經(jīng)系統(tǒng)自我修復(fù)的細胞學(xué)基礎(chǔ)，已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷修復(fù)的研究焦點。通心絡(luò)是近年來開發(fā)的治療腦梗死的有效藥物，大量的動物實驗研究表明，通心絡(luò)對腦缺血再灌注損傷后缺血級聯(lián)反應(yīng)的各個病理環(huán)節(jié)具有改善作用，但有關(guān)通心絡(luò)對腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖分化作用的研究尚未見到，本實驗利用BrdU標記的細胞免疫熒光雙標法研究了

6、不同劑量的通心絡(luò)治療缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)干細胞的增殖和分化，分別檢測了大腦不同區(qū)域的細胞增殖和神經(jīng)元標志β-Tubulin陽性細胞和星形神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志GFAP陽性細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)能促進缺血再灌注腦損傷大鼠腦神經(jīng)干細胞增殖；增殖的神經(jīng)干細胞可分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞；不同的腦區(qū)在缺血再灌注后對通心絡(luò)促進神經(jīng)干細胞增殖的反應(yīng)不一致，其中造模后第7天大鼠海馬顆粒層和齒狀回BrdU陽性細胞熒光強度值最高，第14天時室管膜上皮細

7、胞及室下區(qū)、脈絡(luò)叢上皮細胞的BrdU陽性細胞熒光強度值最高；另外，通心絡(luò)促進神經(jīng)干細胞增殖的持續(xù)時間較長，可達30天。 在通心絡(luò)作用機制的研究中，本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄集合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測了缺血再灌注損傷后不同時間神經(jīng)干細胞增殖分化相關(guān)細胞因子mRNA的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組幾乎檢測不到EPO、IGF-1、EGF、VEGFmRNA的表達；大鼠腦缺血再灌注后在病灶對側(cè)僅見EPO、IGF-1、EGF、VEGFmRNA有少量

8、表達；缺血再灌注模型組EPO、IGF-1、EGF、VEGFmRNA在不同時間段均有表達，EPO、IGF-1、EGF、VEGFmRNA在造模后第3天開始表達增強，隨缺血再灌注時間的延長，PCR表達增加，其中造模后第5天表達最高，與其它時間點相比，統(tǒng)計學(xué)處理有極顯著差異(P＜0.05)；但造模后第14天時，PCR表達下降；第30天恢復(fù)到基線水平。給予通心絡(luò)治療后第3天缺血側(cè)EPO、IGF-1、EGF、VEGFmRNA開始表達增強，其PCR表

9、達灰度值增加度與模型對照組相比無顯著差異；通心絡(luò)治療后第5、7、14、21、30天時PCR表達灰度值均高于缺血對照組，統(tǒng)計學(xué)處理有極顯著差異(P＜0.05)；其中通心絡(luò)大劑量組第5、7、14、21、30天時PCR表達與通心絡(luò)小劑量組比較，統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異(P＞0.05)。表明通心絡(luò)治療5天起，缺血側(cè)神經(jīng)干細胞相關(guān)細胞因子開始大量增殖，并持續(xù)到缺血后第30天，而以通心絡(luò)大劑量組效果最為明顯。 結(jié)論： 1.改良了線栓法大

10、鼠缺血再灌注腦損傷模型，改良后的模型具有操作簡便，易于實行，成功率高，死亡率低，便于推廣等優(yōu)點。 2.通心絡(luò)能促進缺血再灌注腦損傷大鼠神經(jīng)干細胞增殖，并且增殖持續(xù)時間較長，可達30天。 3.增殖的神經(jīng)干細胞可分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞。并且，不同的腦區(qū)在缺血再灌注后對通心絡(luò)促進神經(jīng)干細胞增殖的反應(yīng)不一致。提示通心絡(luò)的促干細胞增殖作用存在一定的細胞選擇性。 4.大鼠腦缺血再灌注后缺血區(qū)腦組織EPO、IGF-

11、1、EGF、VEGFmRNA的表達增強，通心絡(luò)可加強這一反應(yīng)。說明通心絡(luò)處理后的神經(jīng)干細胞增殖可能與之有關(guān)。 綜上所述，本實驗提示在腦缺血再灌注條件下，缺血區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)干細胞的增殖遷移，并分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞。同時，VEGF，EGF，IGF-1以及EPO等細胞因子表達也增多；通心絡(luò)處理實驗大鼠后，上述變化進一步加強。提示通心絡(luò)的神經(jīng)保護作用可能與上述細胞因子和/或神經(jīng)干細胞有關(guān)，詳細的過程和機制還有待我們進一步的研究