SIRT1-PGC-1α對糖尿病小鼠足細胞線粒體氧化損傷與凋亡的影響及白藜蘆醇的干預(yù)研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)由于其高發(fā)率、高致殘率以及高死亡率，多年來一直是腎病領(lǐng)域研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，足細胞在保持腎小球濾過屏障的完整性及預(yù)防蛋白尿的產(chǎn)生中具有重要作用，足細胞損傷可影響DN的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。足細胞是一種高度分化的終末細胞，再生能力差，其多級足突結(jié)構(gòu)功能的正常維持需要大量的能量消耗，對氧化應(yīng)激反應(yīng)相對敏感。正是這些特性導(dǎo)致了足細胞的易損。有研究報道，足細胞是DN最早受損細胞，在

2、DN早期即可出現(xiàn)凋亡、脫落，加重蛋白尿和腎小球硬化的進程。
　　DN的發(fā)病機制非常復(fù)雜，既往大量研究表明，高糖可通過4條經(jīng)典生化途徑誘導(dǎo)腎臟損害，包括糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGE)增加，蛋白激酶C(PKC)激活，多元醇通路與已糖胺途徑的激活。但其之間的相互關(guān)系尚未明確。2001年，Brownlee教授首次提出了“統(tǒng)一機制理論”:認(rèn)為高糖誘導(dǎo)細胞線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過量活性氧(re

3、active oxygen species，ROS)是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的啟動因素。ROS的過度合成可激活上述途徑，進一步促進ROS的積聚，通過直接過氧化生物大分子和激活相關(guān)信號通路等方式，導(dǎo)致細胞的損傷和凋亡，造成糖尿病多器官并發(fā)癥的發(fā)生。通過多年的實驗研究，這一統(tǒng)一理論已被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可。由線粒體誘導(dǎo)的ROS可能在DN發(fā)病中發(fā)揮著起始和關(guān)鍵性作用。
　　線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS增多可將自身作為首要靶目標(biāo)導(dǎo)致線粒體損傷，包括對呼吸鏈及內(nèi)

4、外膜及基質(zhì)蛋白的影響，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生更多，ATP合成減少;進而線粒體膜通透性改變，細胞色素C、AIF和Smac-DIABLO等一系列促凋亡因子外溢，啟動線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。由此可見，線粒體氧化損傷和誘發(fā)細胞凋亡可能是DN的重要致病機制，也有望成為DN治療的新靶點。
　　線粒體生物合成(Mitochondrial biogenesis)是維護和修復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)的生理活動，是介導(dǎo)核基因?qū)€粒體基因及蛋白表達調(diào)控的重要橋梁。

5、研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α是線粒體生物合成的中樞調(diào)節(jié)因子。其可促進線粒體生物合成，增強不同組織細胞有氧呼吸功能。PGC-1α最初是作為核受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的轉(zhuǎn)錄輔激活因子被發(fā)現(xiàn)的，此后一系列的研究表明它在能量平衡、線粒體氧化代謝、熱量控制及糖、脂代謝中發(fā)揮重要作用。作為輔激活因子通過激活和并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NRF1和TFAM的表達，對線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，隨著研究的深入，在多種

6、糖尿病并發(fā)癥中發(fā)現(xiàn)了PGC-1α表達的下調(diào)，提示由其調(diào)控線粒體生物合成受損導(dǎo)致的線粒體功能障礙可能是糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的重要機制之一。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α可被NAD+依賴性去乙酰化酶沉默信息調(diào)節(jié)因子2(sir2)相關(guān)酶1(SIRT1)通過去乙?；饔枚せ睢０邹继J醇(resveratrol)是目前發(fā)現(xiàn)的SIRT1最強的激活劑。具有抗炎、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)糖脂代謝等重要生物學(xué)功效。多數(shù)研究認(rèn)為，其藥理作用的發(fā)揮有賴于SIRT1的

7、激活。近來，白藜蘆醇在腎臟疾病治療中的作用也越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。在DN動物模型中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有降低蛋白尿;減少細胞外基質(zhì)沉積，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡等眾多腎臟保護作用。在心肌和骨骼肌的研究中，有學(xué)者指出，白藜蘆醇可通過激活SIRT1進一步調(diào)節(jié)其下游基因PGC-1α和FOXO來改善線粒體功能。糖尿病腎病時，白藜蘆醇的腎臟保護作用是否也與其激活SIRT1/PGC-1α通路改善線粒體功能，進而減少氧化應(yīng)激和凋亡有關(guān)尚需進一步研究證

8、實。
　　本研究通過建立1型糖尿病小鼠模型和高糖刺激體外培養(yǎng)足細胞，同時應(yīng)用白藜蘆醇以及PGC-1αsiRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)，深入探討線粒體氧化損傷和凋亡在糖尿病足細胞病變中的可能作用機制，為進一步闡明DN的發(fā)病機制及其早期防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.SIRT1/PGC-1α在糖尿病小鼠腎組織的表達及白藜蘆醇對其的干預(yù)研究將健康雄性CD-1小鼠（4-6周）隨機分為3組:正常對照組(normalcontrol

9、group NC組)、糖尿病組(diabetic group DM組)、糖尿病+白藜蘆醇干預(yù)組（diabetic+Resveratrol group DR組）。應(yīng)用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，140 mg/kg)法制備糖尿病小鼠模型，72小時后檢測尾尖血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++～++++確定為糖尿病模型制備成功。DR組給予白藜蘆醇30mg·kg-1·d-1灌胃，每日一次，NC組與DM組僅給

10、予等量溶劑（羧甲基纖維素）灌胃。分別于成模后4、8、12周留取各組小鼠血液及24小時尿液標(biāo)本，用于血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)和尿蛋白定量(urinary protein，UP)的檢測。切取部分腎皮質(zhì)組織于4％中性甲醛固定制備石蠟切片用于PAS、HE病理染色，TUNEL染色以及SIRT1、PGC-1α、NRF

11、1和TFAM免疫組織化學(xué)染色;部分腎皮質(zhì)組織于4％戊二醛固定后用于電鏡觀察;部分腎皮質(zhì)用于提取總蛋白行Western blot檢測SIRT1、PGC-1α、 NRF1、TFAM和Nephrin，cleaved caspase-3的蛋白表達，比色法檢測腎皮質(zhì)MDA含量和Mn-SOD活力變化。
　　2.高糖對足細胞SIRT1/PGC-1α表達及線粒體氧化損傷與凋亡的影響條件性永生化小鼠足細胞在33℃，含有γ-IFN(10U/ml)及1

12、0％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)傳代后，置于37℃，不含γ-IFN的RPMI1640培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)10-14天，待足細胞分化成熟后開始后續(xù)試驗。將實驗細胞隨機分為3組:正常糖組（5.5 mmol/L glucose，NG）、高滲對照組(24.5 mmol/L mannitol，MG)和高糖組(30 mmol/L glucose，HG)。同步化后分組干預(yù)，刺激0、12、24、48、72小時后收集細胞，免疫細胞化學(xué)法檢測SI

13、RT1、PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表達;Real-timePCR檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表達;提取細胞總蛋白行Western blot檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM和Nephrin，cleavedcaspase-3的蛋白表達;提取去線粒體胞漿蛋白行western blot檢測Cyto C和DIABLO的表達;JC-1染色檢測活細胞線粒體膜電位的變化;DCHF-DA染色檢測細胞

14、內(nèi)總ROS含量;MitoSOX染色檢測線粒體ROS的含量;比色法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ的活性變化。AnnexinⅤ/PI染色檢測足細胞凋亡率。
　　3.白藜蘆醇及PGC-1αsiRNA對高糖誘導(dǎo)足細胞線粒體氧化損傷與凋亡的影響將分化成熟的足細胞隨機分為6組:正常糖組(5.5 mmol/L glucose，NG組)，高糖組（glucose30 mmol/L，HG組），高糖+白藜蘆醇干預(yù)組(glucose30 mmol/L+re

15、sveratrol10μmol/L,HG+Res組)，高糖+EX527干預(yù)組（glucose30 mmol/L+EX52710μmol/L，HG+EX527組），高糖+PGC1 siRNA干預(yù)組(glucose30 mmol/L+PGC1 siRNA,HG+PGC1 siRNA組)和高糖+PGC1 siRNA+白藜蘆醇干預(yù)組(glucose30 mmol/L+PGC1siRNA+resveratrol10μmol/L，HG+PGC1 s

16、iRNA+Res組)，各組同步化后干預(yù)48h收集細胞，Real-time PCR檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAMmRNA表達;提取細胞總蛋白行Western blot檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM和Nephrin，cleaved caspase-3的蛋白表達;提取去線粒體胞漿蛋白行western blot檢測Cyto C和DIABLO的表達;JC-1染色檢測活細胞線粒體膜電位的變化;DCHF-DA染色檢

17、測細胞內(nèi)總ROS含量;MitoSOX染色檢測線粒體ROS的含量;比色法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ的活性變化。AnnexinⅤ/PI染色檢測足細胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.SIRT1/PGC-1α在糖尿病小鼠腎組織的表達及白藜蘆醇對其的干預(yù)研究①生化結(jié)果顯示:4周時，DM組小鼠尿蛋白較NC組升高，且隨病程延長呈上升趨勢;8周時，DM組BUN和TC水平升高，12周時升高更加顯著。DR組小鼠蛋白尿水平較同時期DM組降低;12

18、周時，DR組TC和BUN水平均較DM組改善。②光鏡下觀察:DM組小鼠4周時出現(xiàn)腎小球直徑增大，系膜區(qū)基質(zhì)增多;8周時，腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性;12周時，腎小球內(nèi)系膜區(qū)增寬更為顯著，并可見腎間質(zhì)水腫，部分腎小管擴張，腎小管上皮細胞脫落再生。③電鏡下觀察，12周時DM組小鼠腎小球基底膜明顯不均勻增厚，足突廣泛融合，裂孔隔膜消失，足細胞線粒體數(shù)量減少，并出現(xiàn)腫脹、空泡變、內(nèi)部膜及嵴結(jié)構(gòu)紊亂消失等病理改變;DR組上述病變均有所改善。④比色法

19、檢測結(jié)果顯示，DM組小鼠腎皮質(zhì)MDA含量較NC組明顯升高，且隨病程延長呈上升趨勢，而Mn-SOD活性則較同時期NC組降低，12周時，降低最為明顯。DR組較同時期DM組有所改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。⑤TUNEL染色結(jié)果顯示:8周時，DM組小鼠腎小球及腎小管間質(zhì)中均可見凋亡細胞，12周時，凋亡細胞數(shù)量較NC組明顯增多。DR組凋亡現(xiàn)象較DM組有所減輕。⑥免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM在NC組腎小球固有細胞及腎

20、小管上皮細胞中均可見陽性表達。其中SIRT1、NRF1主要表達于胞核;PGC-1α在胞核和胞漿中均有表達，以胞漿表達更為明顯;TFAM則主要表達于胞漿中。8周時，DM組上述指標(biāo)的陽性表達較NC組減少，12周時，減少更為顯著。⑦Western blot結(jié)果顯示:DM組腎皮質(zhì)SIRT1蛋白表達在4周時已較正常組減低，隨病程延長，下降更為顯著。而PGC-1α、NRF1和TFAM的表達在8周時表達下調(diào)，12周時下調(diào)更加明顯。DR組上述4種蛋白表

21、達均較DM組增多，但仍低于同時期NC組。12周時，DM組小鼠腎皮質(zhì)Nephrin表達較NC組明顯減低，cleavedcaspase3表達較NC組明顯升高，DR組上述兩指標(biāo)均較DM組改善。
　　2.高糖對足細胞SIRT1/PGC-1α表達及線粒體氧化損傷與凋亡的影響①免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM在NG組均可見陽性表達，SIRT1、NRF1主要表達于細胞核;PGC-1α胞漿、胞核均有陽性表達，以胞

22、漿表達更為明顯;TFAM主要表達于胞漿中。HG組上述蛋白均較NG組陽性表達減少。②Western blot顯示，高糖干預(yù)12h，SIRT1表達較0h降低，隨干預(yù)時間延長，表達呈遞減趨勢;PGC-1α表達在12h略有增加，NRF1和TFAM則較0h無明顯變化，三者均從高糖干預(yù)24h開始，呈時間依賴性遞減，72h降低最為顯著。③real time PCR結(jié)果顯示，高糖刺激呈時間依賴性引起SIRT1 mRNA表達降低，以48h減低最顯著。PG

23、C-1α、NRF1、TFAM mRNA減低發(fā)生在高糖刺激24h，此后隨干預(yù)時間延長表達逐漸下調(diào)。④Western blot結(jié)果顯示，高糖干預(yù)下，足細胞Nephrin蛋白呈時間依賴性下調(diào)，cleaved caspase3則呈逐漸上調(diào)趨勢。去除線粒體的胞質(zhì)蛋白中Cyto C和Diablo蛋白也隨高糖干預(yù)時間延長表達升高。⑤流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，高糖干預(yù)12h，細胞內(nèi)總ROS含量較0h升高，且隨時間延長呈遞增趨勢。⑥熒光顯微鏡下顯示，高糖干

24、預(yù)12h時，足細胞線粒體中ROS含量較未干預(yù)時明顯增多，且隨干預(yù)時間延長熒光強度逐漸增強。⑦比色法結(jié)果顯示，高糖干預(yù)24h，足細胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性下降，48h、72h降低更為明顯，⑧足細胞線粒體膜電位隨高糖干預(yù)時間延長呈降低趨勢，共聚焦顯微鏡下可見由紅色熒光向綠色熒光的轉(zhuǎn)變過程。⑨流式細胞儀檢測顯示，足細胞凋亡率隨高糖干預(yù)時間延長逐漸上調(diào)。
　　3.白藜蘆醇及PGC-1α siRNA對高糖誘導(dǎo)足細胞線粒體氧化損傷與凋亡

25、的影響①Western blot與Real time PCR檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48h，HG組SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白及mRNA表達量均較NG組明顯降低，HG+Res組上述4種蛋白及mRNA表達較HG組升高，而HG+EX527組則均較HG組進一步降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②Western blot檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48h，HG組Nephrin蛋白表達量較NG組降低，HG+EX527組降低更加顯著;HG+Res組其表達

26、量較HG組升高。HG組cleaved caspase3的表達較NG組升高，HG+EX527組上升更為顯著;HG+Res組其表達量較HG組降低。去線粒體胞質(zhì)蛋白中Cyto C、DIABLO的表達在HG組也較NG組明顯升高，HG+Res組其表達量較HG組有所降低，HG+EX527組升高較HG組更為明顯。③HG+PGC1 siRNA組SIRT1表達較HG組無明顯變化，HG+PGC1 siRNA+Res組SIRT1表達較HG組升高，與HG+Re

27、s組表達無明顯差異。HG+PGC1 siRNA組PGC-1α、NRF1和TFAM表達均較HG組明顯降低，HG+PGC1 siRNA+Res組上述3種蛋白較HG+Res組表達降低，同HG+PGC1 siRNA組無明顯差異。④HG+PGC siRNA組Nephrin表達較HG組進一步減低，HG+PGC siRNA+Res組表達低于HG+Res組。HG+PGC1 siRNA組cleaved caspase3與HG組相比表達升高，HG+PGC1

28、 siRNA+Res組表達量高于HG+Res組。⑤流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48h，HG+Res組線粒體內(nèi)ROS合成量較HG組明顯降低，而HG+EX527組較HG組進一步升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。⑥HG+Res組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性及線粒體膜電位均較HG組有所上升，而HG+EX527組較HG組減低更加顯著。⑦HG組足細胞內(nèi)總ROS含量較NG組明顯升高，HG+EX527組升高更加明顯，HG+Res組足細胞內(nèi)總ROS含量較HG組明

29、顯降低。HG+PGC1 siRNA組則較HG組含量更高，HG+PGC1 siRNA+Res組較HG+PGC1 siRNA組有所降低，但明顯高于HG+Res組。⑧HG組足細胞凋亡率明顯高于NG組，HG+EX527組較HG組升高更加顯著，HG+Res組與HG組比較，凋亡率明顯降低。HG+PGC1siRNA組凋亡率高于HG組，HG+PGC1 siRNA+Res組較HG+PGC1 siRNA組有所降低，但明顯高于HG+Res組。
　　結(jié)論

30、:
　　1.糖尿病小鼠腎組織、高糖培養(yǎng)的小鼠足細胞均出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，細胞凋亡率升高;并伴有腎組織與足細胞內(nèi)SIRT1、PGC-1α的表達下調(diào)。
　　2.糖尿病小鼠腎小球足細胞出現(xiàn)線粒體形態(tài)異常，裂孔隔膜消失，足突融合，凋亡等病理改變，高糖誘導(dǎo)足細胞內(nèi)線粒體ROS合成增多，呼吸鏈復(fù)合物活性下降，線粒體膜電位降低，線粒體凋亡途徑被激活。提示線粒體功能障礙參與了糖尿病足細胞的氧化損傷與凋亡。
　　3.白藜蘆醇可上調(diào)糖尿

31、病小鼠腎組織SIRT1、PGC-1α表達，改善糖尿病小鼠足細胞內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常及足突融合，上調(diào)裂孔隔膜蛋白nephrin的表達，減少足細胞凋亡的發(fā)生。其減少尿蛋白的機制可能與足細胞保護作用有關(guān)。
　　4.白藜蘆醇可上調(diào)高糖環(huán)境中足細胞SIRT1、PGC-1α及其下游基因的表達;減少高糖環(huán)境下足細胞線粒體ROS合成增多，改善呼吸鏈復(fù)合物活性，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡通路的激活。
　　5.白藜蘆醇可能通過SIRT1/