細胞增殖分化過程中的實時分子成像研究.pdf

1、腫瘤細胞大多體現(xiàn)出異常增殖的細胞學(xué)行為。此外，腫瘤干細胞(cancer stem cells(CSCs))對腫瘤惡性進展的不良影響已被證實。CSCs的數(shù)量稀少，但其增殖、分化等細胞生物學(xué)行為對腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的影響。能量代謝是細胞生命活動的基礎(chǔ)。不同表型的細胞可能具有不同的能量代謝狀態(tài)。研究表明，CSCs的代謝方式異于其分化的后代。對于腫瘤細胞尤其是CSCs來說，其代謝方式可隨所處微環(huán)境因素變化而發(fā)生轉(zhuǎn)變。不僅如此，腫瘤所處的微

2、環(huán)境也極大地影響著細胞的各種生物學(xué)行為。動態(tài)研究微環(huán)境對細胞的各種生物學(xué)動態(tài)變化的影響有著極為重要的意義。
　　微流控芯片在模擬腫瘤微環(huán)境用于細胞-細胞及細胞-細胞微環(huán)境相互作用的研究中富有廣闊前景。此外，細胞的個體差異性往往表現(xiàn)為對同一刺激的響應(yīng)程度、時間的差異，而熒光成像具有靈敏度高，實時分析的特點，因此適用于單細胞水平的實時動態(tài)分析。熒光實時成像結(jié)合微流控芯片腫瘤細胞模型用于腫瘤細胞生物學(xué)研究，對于獲取細胞轉(zhuǎn)化、運動過程中特

3、定分子的變化信息極具優(yōu)勢。
　　本論文以研究腫瘤細胞的增殖、分化中的重要轉(zhuǎn)變過程為出發(fā)點，發(fā)展實時熒光成像的方法，動態(tài)追蹤重要轉(zhuǎn)變過程中的特定分子變化，并建立微流控細胞微環(huán)境模型，研究微環(huán)境因素變化對細胞生物學(xué)行為的影響。主要開展了以下工作:
　　首先基于微流控芯片，綜述了細胞生物學(xué)的體外研究相關(guān)進展，利用微流控芯片易于操控模擬體內(nèi)微環(huán)境的特點，結(jié)合熒光實時成像高靈敏度的優(yōu)勢，開發(fā)針對腫瘤增殖、腫瘤干細胞分化相關(guān)的熒光實時成

4、像方法，對這兩個重要的細胞生物學(xué)過程中的特定分子進行實時追蹤，并進一步結(jié)合到微流控芯片模擬腫瘤微環(huán)境的研究中，考察腫瘤微環(huán)境影響因素pH對腫瘤干細胞分化侵襲的影響。具體內(nèi)容如下。
　　先構(gòu)建一種雙靶標(biāo)mRNA探針體系用于標(biāo)記細胞周期G1期停滯，通過針對G1期停滯調(diào)控相關(guān)的兩個關(guān)聯(lián)基因MYC和CDKN1A mRNA的實時成像，實現(xiàn)對G1停滯的識別，并基于該成像方法研究了HIF-α在G1期停滯調(diào)控中的作用。該法可用于追蹤單細胞內(nèi)的動態(tài)

5、變化，結(jié)果直觀清晰，易于識別。綠色及紅色熒光的空間和時間分布變化可用于指示不同階段的周期停滯。我們將這種方法成功應(yīng)用于研究HIF-1α在區(qū)分“良性”和“不良”細胞周期停滯中的作用，證明其應(yīng)用于動態(tài)觀察G1期阻滯的可靠性。
　　接著以實時研究細胞能量代謝狀態(tài)為目的，構(gòu)建極化ATP探針，用于研究膠質(zhì)瘤干細胞(GSCs)發(fā)生間葉性分化的能量代謝狀態(tài)變化。通過實時監(jiān)測活細胞內(nèi)ATP的水平來反映是否發(fā)生能量代謝方式的改變;探針顯示的亞細胞分

6、布可反映細胞對氧化磷酸化和糖酵解途徑的依賴性。線粒體共定位ATP成像熒光強度的增強現(xiàn)象提示，TGFβ的刺激能夠增強GSCs分化期間的氧化磷酸化作用。GSCs依賴于氧化磷酸化代謝方式，并且這種依賴性在分化的細胞中喪失，但通過對比添加TGFβ誘導(dǎo)分化的細胞與單純只由低含量FBS誘導(dǎo)分化的細胞發(fā)現(xiàn)，由TGFβ誘導(dǎo)分化發(fā)生較高比例的間葉性分化，這類細胞對氧化磷酸化的依賴有所增加。因此，我們通過能量代謝的熒光實時成像發(fā)現(xiàn)了間葉性分化GSCs相比其

7、他分化的GSCs具有較高的氧化磷酸化依賴性;該法具有實時成像分析的特點，在研究處于不同階段的細胞的能量代謝中體現(xiàn)出優(yōu)勢。
　　最后基于微流控芯片平臺構(gòu)建三維細胞侵襲模型。在腫瘤干細胞單獨培養(yǎng)及與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的情況下，由上述熒光成像方法輔助研究pH對腫瘤干細胞分化侵襲行為的影響。在我們的侵襲模型中，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)的硬度抑制了細胞以變形蟲模式遷移，也正如我們觀察到的，大多數(shù)侵襲的細胞表現(xiàn)出間充質(zhì)樣形態(tài)。在pH梯度下，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)生侵