吉西他濱清除MDSC及促進DC成熟對淋巴瘤的治療作用與機制研究.pdf

1、當前各類淋巴瘤中以B細胞淋巴瘤的發(fā)病率最高，其中濾泡淋巴瘤及小淋巴細胞淋巴瘤對DC免疫治療較為敏感，國外已經(jīng)開展了多項臨床試驗，初步觀察到一定的療效，但沒有獲得最終的成功，離臨床廣泛應用還有較大的差距，主要是目前使用的DC免疫治療策略仍難以克服淋巴瘤復發(fā)的問題。
　　增強DC免疫治療療效的一個策略是清除腫瘤患者體內(nèi)異常增多的免疫抑制細胞。近年來大量研究顯示多種類型的腫瘤（包括淋巴瘤）患者體內(nèi)的髓系來源抑制細胞(myeloid-de

2、rived suppressor cell，MDSC)異常增多，大量累積的MDSC是腫瘤患者體內(nèi)主要的免疫抑制細胞，MDSC能夠通過分泌多種抑制因子，抑制T細胞及NK細胞的功能，在腫瘤的免疫逃逸中起著重要的作用。應用化療藥物清除免疫抑制細胞可以成為DC疫苗治療的重要協(xié)同策略。一項研究顯示低劑量吉西他濱可以選擇性清除間皮瘤荷瘤小鼠體內(nèi)的MDSC，而不殺傷T細胞和B細胞。因此通過吉西他濱化療一方面可以殺傷腫瘤細胞降低腫瘤負荷，另一方面可以清

3、除體內(nèi)MDSC而有效解除免疫抑制。
　　增強DC免疫治療療效的另一個策略是改變目前DC疫苗的接種模式，以往大都采用腫瘤抗原體外沖擊的DC作為疫苗，通過皮下注射等方式進行接種，這種方法并不符合體內(nèi)DC抗腫瘤的生理過程，存在諸多不足。改用未經(jīng)體外抗原沖擊的半成熟(semi-mature)DC瘤內(nèi)注射的方法進行免疫接種，能夠更好地保持DC的活性和功能，在瘤體內(nèi)注射后可以更加直接、充分地接觸、攝取腫瘤細胞死亡后釋放的抗原及DAMP(dam

4、age associated molecular pattern)，分化為成熟的DC。這一方法更加符合體內(nèi)DC抗腫瘤的生理過程，并且在數(shù)量和質(zhì)量上能夠更加保證對抗腫瘤免疫功能的充分激發(fā)。
　　目前尚不明確MDSC是否能夠促進小鼠B細胞淋巴瘤的生長、淋巴瘤荷瘤小鼠體內(nèi)的MDSC是否增多、增多的MDSC對吉西他濱化療是否敏感，以及在吉西他濱化療后序貫進行瘤內(nèi)注射半成熟DC治療淋巴瘤，二者是否能夠發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應。
　　目的:<

5、br>　　1建立小鼠MDSC體外培養(yǎng)新體系:模擬MDSC在體內(nèi)發(fā)育生成的微環(huán)境，擴增出大量高純度的MDSC，研究其對小鼠B細胞淋巴瘤體內(nèi)生長的影響;
　　2進一步檢測淋巴瘤荷瘤小鼠體內(nèi)MDSC的數(shù)量及吉西他濱對小鼠MDSC的體內(nèi)外清除作用，觀察經(jīng)過吉西他濱處理的淋巴瘤細胞對半成熟DC分化成熟的影響;
　　3最后應用吉西他濱化療后序貫進行瘤內(nèi)注射半成熟DC的方案治療小鼠B細胞淋巴瘤，檢測小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫功能并觀察二者是否能夠

6、發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應，并分析哪種免疫效應細胞起主要的作用。
　　方法:
　　1.以絲裂霉素C滅活的脾臟內(nèi)皮型基質(zhì)細胞107B作為飼養(yǎng)層細胞，加入小鼠骨髓細胞及高劑量mGM-CSF，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)獲MDSC;以流式細胞儀檢測細胞免疫表型;抗Gr-1抗體標記后免疫磁珠進一步分選純化MDSC，應用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基進行集落形成細胞檢測，以及尾靜脈回輸全身照射(8Gy)的小鼠檢測脾集落形成單位(CFU-S);應用熒光探針DCF

7、DA檢測ROS的產(chǎn)生，異去硝基苯丙酮測尿素法測定精氨酸酶;CCK8法檢測MDSC體外對Con-A刺激的T細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測MDSC對OT-1小鼠來源的OVA多肽特異性CD8+T細胞（CFSE標記）增殖的影響;流式檢測MDSC回輸Foxp3-IRES-GFP小鼠后外周血Treg細胞的比例變化;應用急性GVHD模型觀察MDSC回輸后小鼠的排異癥狀以及小鼠的生存率;MDSC與A20淋巴瘤細胞共同皮下接種后監(jiān)測淋巴瘤體內(nèi)生長的情況。

8、
　　2.皮下接種2×105的A20細胞建立小鼠淋巴瘤模型，第30天小鼠皮下形成直徑＞2.0cm的淋巴瘤后，取小鼠脾臟，抗Gr-1-PC5、抗CD11b-PE抗體標記后流式細胞儀檢測荷瘤小鼠脾臟內(nèi)MDSC的比例;免疫磁珠分選Gr-1+的荷瘤小鼠脾臟MDSC，流式檢測細胞免疫表型;分選獲得的MDSC加入吉西他濱（10μg/ml）培養(yǎng)24h、48h后，以AnnexinⅤ-FITC/PI染色后流式檢測凋亡;荷瘤30天的小鼠腹腔注射120

9、mg/kg吉西他濱，48h后流式檢測小鼠脾臟中MDSC的比例及淋巴瘤細胞發(fā)生凋亡的比例;小鼠骨髓細胞加入mGM-CSF培養(yǎng)獲半成熟DC，加入經(jīng)吉西他濱（10μg/ml）預處理4h的A20細胞，混勻共同培養(yǎng)48h后標記抗CD11c-APC和抗CD86-PE抗體，流式分析DC的成熟分化情況;荷瘤30天的小鼠腹腔注射120mg/kg吉西他濱，48h后序貫進行瘤內(nèi)注射5×106的CFSE標記DC，48h后取小鼠外周血、脾臟及DC注射部位的腫瘤組

10、織制備細胞懸液，標記抗CD11c-APC和抗CD86-PE抗體，流式分析DC的成熟分化情況。
　　3.取荷瘤30天的小鼠隨機分組，腹腔注射吉西他濱(120mg/kg)或生理鹽水，第32天瘤內(nèi)注射DC或生理鹽水，5組分別為:a.腹腔注射生理鹽水+瘤內(nèi)注射生理鹽水(NS組)、b.腹腔注射生理鹽水+瘤內(nèi)注射DC5×105/只（DC組）;c.腹腔注射吉西他濱+瘤內(nèi)注射生理鹽水（GEM組）;d.腹腔注射吉西他濱+瘤內(nèi)注射DC5×105/只（

11、GEM+DC組）;e.腹腔注射吉西他濱+瘤內(nèi)注射DC5×105/只+MDSC5×106/只（GEM+DC+MDSC組），觀察腫瘤的生長情況，每3天測量小鼠移植瘤的長徑及短徑，觀察各組小鼠的生存時間;DC瘤內(nèi)注射后第7天，取各組3只小鼠脾臟制備細胞懸液，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平;小鼠脾臟細胞加絲裂霉素C滅活的A20細胞及50IU/mL的mIL-2體外培養(yǎng)5天后，LDH釋放法檢測對A20細胞的殺傷;取各組小鼠脾臟及腫瘤組織制

12、備單細胞懸液，分別加入抗CD4-PE、抗CD8-FITC及抗DX5-PE抗體標記后流式檢測T細胞及NK細胞的比率;取各組小鼠腫瘤組織經(jīng)4％多聚甲醛溶液固定后切片，加入抗DX5-PE抗體及抗NKG2D-FITC抗體孵育后，DAPI液核染色后激光掃描共聚焦顯微鏡檢測瘤內(nèi)NK細胞的數(shù)量;在淋巴瘤接種后的第24、26、28、30、32及35天給小鼠腹腔注射300mg的抗asialo-GM1抗體清除體內(nèi)NK細胞，或給小鼠腹腔注射100mg的抗CD

13、4抗體(GK1.5)及抗CD8抗體(TIB105)清除體內(nèi)T細胞，觀察體內(nèi)清除這些免疫細胞后對吉西他濱與DC聯(lián)合治療淋巴瘤療效的影響。
　　結果:
　　1.應用小鼠脾臟內(nèi)皮型基質(zhì)細胞作為飼養(yǎng)細胞，模擬MDSC體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境，從單只小鼠的骨髓細胞體外培養(yǎng)9天可以獲得4×108細胞，其中CD11b+Gr-1+的MDSC的比例達90％，與荷瘤小鼠體內(nèi)MDSC的免疫表型相似。體外CFC檢測表明培養(yǎng)第7天生成大量CFU-GM、少量C

14、FU-G及部分散在的成熟的單核細胞，而不生成其它集落;1×103MDSC回輸輻照小鼠后可以生成平均12-15個晚期脾結節(jié)。生成的MDSC具有極強的免疫抑制活性，能夠抑制Con-A刺激的T細胞增殖以及OVA多肽刺激的抗原特異性CD8+T細胞增殖;MDSC回輸小鼠后外周血中Treg細胞的比例增高3倍左右，能夠抑制急性GVHD，減輕GVHD癥狀，小鼠的死亡率由100％降至40％;與A20淋巴瘤細胞共同接種后淋巴瘤在小鼠的體內(nèi)的生長速度明顯加快

15、。
　　2.在接種A20淋巴瘤細胞30天后的小鼠脾臟中MDSC的比例顯著增高達30％左右，MDSC的絕對數(shù)量超過正常小鼠的10倍。體外MDSC經(jīng)10ug/ml吉西他濱處理48h后83.2％的細胞發(fā)生了凋亡，應用吉西他濱化療后荷淋巴瘤小鼠脾臟中MDSC的比例降為69％;吉西他濱化療也導致體內(nèi)A20淋巴瘤細胞發(fā)生凋亡。經(jīng)吉西他濱預處理4h的A20細胞與DC共同培養(yǎng)48h后，DC表達CD86的比例由11.3％增加至49.6％;荷淋巴瘤小

16、鼠給予吉西他濱化療后瘤內(nèi)注射半成熟DC，48h后可以檢測到回輸?shù)腄C中有82.8％轉變?yōu)镃D86+表型，而未接受化療組僅為26.2％。
　　3.荷淋巴瘤小鼠接受吉西他濱注射后序貫進行瘤內(nèi)注射半成熟DC的治療后，小鼠脾細胞分泌的IFN-γ較對照組增高近10倍，殺傷A20腫瘤細胞的CTL活性顯著增高，腫瘤逐漸縮小并最終消失，90％的小鼠獲得長期生存，而對照組小鼠均最終死亡。接受聯(lián)合治療的淋巴瘤荷瘤小鼠，流式檢測脾臟內(nèi)及瘤內(nèi)CD4+及C

17、D8+T細胞的比例與其他組無顯著差異，而瘤內(nèi)NK細胞比例由2.2％增高至6.9％，應用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡檢測進一步證實，瘤內(nèi)浸潤的NK細胞較對照組顯著增加;單抗體內(nèi)清除實驗表明，清除CD8+T細胞、NK細胞后聯(lián)合治療組的抗腫瘤效應均有所減弱，而清除NK細胞組的作用最為明顯，腫瘤的生長速度與對照組接近。
　　結論:
　　1.成功建立了體外大規(guī)模擴增高純度小鼠MDSC的培養(yǎng)體系，體外培養(yǎng)生成的MDSC具有強烈的免疫抑制活性

18、，與A20淋巴瘤細胞共同接種小鼠能夠顯著促進淋巴瘤的生長。
　　2.接種A20淋巴瘤細胞的小鼠在后期體內(nèi)也出現(xiàn)MDSC累積增多的現(xiàn)象，吉西他濱可以誘導MDSC發(fā)生凋亡，快速去除荷淋巴瘤小鼠體內(nèi)的MDSC，也可以誘導A20淋巴瘤細胞發(fā)生凋亡，并促進瘤內(nèi)DC的分化成熟。
　　3.吉西他濱化療后序貫進行瘤內(nèi)注射治療半成熟DC可以產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應，可以激活體內(nèi)免疫細胞，有效清除巨大淋巴瘤并阻止復發(fā)，顯著提高小鼠存活率。CD8+T細