羅格列酮對(duì)高脂血癥性胰腺炎大鼠腎臟損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制探討.pdf

1、高脂血癥是急性胰腺炎的危險(xiǎn)因素之一，近年來高脂血癥性胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HP)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，有證據(jù)證明HP導(dǎo)致的并發(fā)癥更為嚴(yán)重，發(fā)病率更高。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)在HP中的發(fā)生率較高，是HP導(dǎo)致死亡的常見原因之一。
　　目前HP導(dǎo)致AKI的確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究報(bào)道認(rèn)為脂代謝紊亂、腎血流動(dòng)力學(xué)異常、微循環(huán)障礙和炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的作用是

2、HP并發(fā)AKI的主要原因。尚未有一種特效的治療方法，臨床治療上以血液凈化為核心的綜合治療方法仍為首選。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶增殖物活化受體γ(PPARγ)是一個(gè)細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)，其代表藥物羅格列酮能夠有效緩解?；悄懰徕c(sodium taurocholate，sTCA)誘導(dǎo)的急性胰腺炎癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，它是否可能對(duì)腎臟具有保護(hù)性作用尚不清楚。本研究旨在從更全面的角度

3、探討Hp誘發(fā)AKI的發(fā)病機(jī)制，重點(diǎn)觀察羅格列酮對(duì)HP合并腎損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。為有效防治急性胰腺炎腎損傷提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分:羅格列酮對(duì)高脂血癥性胰腺炎大鼠腎臟損傷保護(hù)作用
　　目的：
　　1、建立高脂血癥性大鼠腎臟損傷動(dòng)物模型。
　　2、觀察羅格列酮對(duì)大鼠血清淀粉酶和血脂含量的影響。
　　3、觀察羅格列酮對(duì)大鼠腎功能及腎臟病理變化的影響。
　　方法：
　　1、通過高脂

4、飲食4周誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠動(dòng)物模型，逆行胰膽管注射5％?；悄懰徕c建立大鼠HP模型。實(shí)驗(yàn)分6組，正常飲食對(duì)照組(Normal)、正常飲食+逆行胰膽管注射?；悄懰徕c組(AP)、高脂飲食組(HFD)、高脂飲食+逆行胰膽管注射?；悄懰徕c組(HP)、正常飲食對(duì)照+羅格列酮組(N+Ros)、高脂飲食+逆行胰膽管注射牛磺膽酸鈉+羅格列酮組(HP+Ros)。造模后48h處死大鼠取材。
　　2、取6組大鼠血清，觀察各組大鼠血清淀粉酶、甘油三酯、總

5、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮含量。
　　3、取6組大鼠腎臟組織，PAS染色觀察腎組織病理變化并進(jìn)行半定量病理學(xué)評(píng)分。電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：
　　1、與Normal組相比，AP組、Hp組血清淀粉酶明顯增高(p＜0.01)，與Normal組相比AP組、HFD組、HP組甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白明顯增高(p＜0.01)。與HP組相比HP+Ros組甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白明顯

6、下降(p＜0.01)。
　　2、與Normal組相比，AP組、HP組血清肌酐水平明顯增高(p＜0.01)，與HP組相比HP+Ros組肌酐水平明顯下降(p＜0.01)。與Normal組相比，AP組、HFD組、HP組血清尿素氮水平明顯增高(p＜0.01)，與HP組相比HP+Ros組尿素氮水平明顯下降(p＜0.01)。
　　3、PAS染色顯示，與Normal組比較AP組、HFD組、HP組腎小管損傷指數(shù)增高(p＜0.001)，與HP

7、組相比HP+Ros組腎小管損傷指數(shù)下降(p＜0.05)。電鏡下HFD組腎臟足細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，部分足突寬度明顯增加，部分可見融合，并有微絨毛形成。HP組內(nèi)皮孔隙消失，足突大部分融合，結(jié)構(gòu)紊亂。濾過膜薄厚不均勻，足突寬度明顯增加，大部分可見融合。HP+Ros足細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，體積增大，部分可見融合，并有微絨毛形成。
　　結(jié)論：
　　高脂飼料喂養(yǎng)4周結(jié)合逆行胰膽管注射5％?；悄懰徕c溶液可成功建立HP大鼠腎損傷模型。羅格列酮可以降低

8、HP組大鼠血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平，減輕腎小管損傷，減輕HP時(shí)腎臟腎小球?yàn)V過膜的損傷。
　　第二部分:羅格列酮在高脂血癥性胰腺炎大鼠腎損傷炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制
　　目的：
　　1、觀察羅格列酮對(duì)HP大鼠腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤及趨化因子、炎癥因子表達(dá)的影響。
　　2、研究羅格列酮對(duì)HP大鼠腎臟組織凋亡的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　1、通過高脂飲食4周誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠動(dòng)物模型，逆行胰膽管

9、注射5％?；悄懰徕c建立大鼠HP模型。共分6組，同第一部分。
　　2、檢測(cè)各組大鼠腎臟組織MPO活性。
　　3、ELISA法檢測(cè)大鼠腎臟組織中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白含量。
　　4、Real time PCR檢測(cè)大鼠腎臟組織中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表達(dá)。
　　5、免疫組化檢測(cè)腎臟組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤及巨噬細(xì)胞浸潤情況。
　　6、TUNEL染色檢測(cè)大鼠腎臟

10、組織凋亡情況。
　　7、Western blot檢測(cè)大鼠腎臟Bax、Bcl-2及cleaved-caspase-3等相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、與Normal組相比AP、HFD、HP組大鼠腎組織MPO活性明顯增加(p＜0.01);與HP組比較HP+Ros組腎組織MPO活性顯著下降(p＜0.001)。
　　2、與Normal組相比AP、HFD、HP組大鼠腎組織MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β

11、蛋白表達(dá)水平顯著增加(p＜0.001);與HP組比較HP+Ros組腎組織MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著下降(p＜0.001)。
　　3、與Normal組相比AP、HFD、HP組大鼠腎組織MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1βmRNA表達(dá)水平顯著增加(p＜0.001);與HP組比較HP+Ros組腎組織MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表達(dá)水平均顯著下降(p＜0.001)。

12、r>　　4、免疫組化染色結(jié)果顯示HP組大鼠腎臟組織中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤增加，HP+Ros組中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞較相應(yīng)胰腺炎模型組明顯減少。
　　5、TUNEL染色結(jié)果顯示HP大鼠腎臟細(xì)胞凋亡明顯增加(p＜0.001)，與HP組比較，HP+Ros凋亡細(xì)胞明顯減少，凋亡率顯著降低(p＜0.001)。
　　6、與Normal組相比較，AP、HFD、HP組Bax和cleaved-caspase-3蛋白在腎組織中表達(dá)明顯升高(p＜

13、0.001)，而Bcl-2蛋白卻顯著下降(p＜0.001);經(jīng)羅格列酮干預(yù)后HP+Ros組較HP組Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)有所下降，而Bcl-2蛋白表達(dá)卻明顯上調(diào)(p＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　1、羅格列酮能夠下調(diào)高脂血癥胰腺炎大鼠腎組織中MPO、以及趨化因子、炎癥因子蛋白、mRNA水平表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕HP大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)。
　　2、羅格列酮能減少高脂血癥胰腺炎大鼠腎臟細(xì)

14、胞凋亡。
　　第三部分:羅格列酮對(duì)高脂血癥性胰腺炎大鼠腎臟MAPKNF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用及機(jī)制
　　目的：
　　探討羅格列酮對(duì)HP大鼠腎臟MAPK NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1、通過高脂飲食4周誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠動(dòng)物模型，逆行胰膽管注射5％?；悄懰徕c建立大鼠HP模型。造模前1h及造模后24h后，HP+Ros組和N+Ros組經(jīng)腹腔注射10mg/kg羅格列酮。
　　2、

15、Western blot分別檢測(cè)Normal組，HP組，N+Ros組，HP+Ros組大鼠腎臟PPARγ受體的表達(dá)。
　　3、Western blot檢測(cè)大鼠腎臟p65、p-p65蛋白表達(dá)，免疫組化檢測(cè)大鼠腎臟NF-kB p65表達(dá)。
　　4、Western blot檢測(cè)大鼠腎臟p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、高脂血癥性胰腺炎大鼠腎組織組中PPARγ蛋白表達(dá)顯著下降(p＜0.001

16、)，而經(jīng)羅格列酮干預(yù)后可使腎組織PPAR-γ的水平升高(p＜0.001)至接近正常水平。
　　2、高脂血癥性胰腺炎大鼠腎組織組中p-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著增高，而經(jīng)羅格列酮干預(yù)后HP+Ros組p-p38MAPK蛋白表達(dá)降低(p＜0.001)至接近正常水平。但各組之間p38MAPK蛋白水平無顯著差異。
　　3、免疫組化染色結(jié)果顯示HP組大鼠腎臟組織中小管間質(zhì)細(xì)胞NF-κBp65陽性表達(dá);HP+Ros組陽性表達(dá)較相應(yīng)胰腺炎模

17、型組明顯減少。HP組NF-κB p-p65蛋白在腎組織中表達(dá)顯著增高，而經(jīng)羅格列酮干預(yù)后HP+Ros組NF-κB p-p65蛋白表達(dá)可降低(p＜0.001)至接近正常水平。但各組之間NF-κBp65蛋白水平無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　在高脂血癥胰腺炎大鼠腎組織中NF-κBP65和MAPK P38呈高磷酸化水平，NF-κB和MAPK P38信號(hào)通路的呈激活狀態(tài)。
　　羅格列酮抑制NF-κB和MAPK P38信號(hào)通路的激