肥胖致小鼠肝臟糖代謝紊亂的機(jī)制及飲食限制的改善作用.pdf

1、背景:
　　胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)與肥胖誘導(dǎo)產(chǎn)生的高血糖和2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)密切相關(guān)，IR是肝臟能量代謝、尤其是糖異生過(guò)程出現(xiàn)紊亂的中心環(huán)節(jié)。其詳盡分子機(jī)制尚未闡明。通過(guò)飲食干預(yù)緩解機(jī)體的肥胖癥狀是否會(huì)改善其肝臟內(nèi)部代謝紊亂的狀況，尤其是失調(diào)的糖異生水平，此直接關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究旨在建立穩(wěn)定的小鼠模型來(lái)探討肥胖誘發(fā)肝臟糖代謝紊亂的分子機(jī)制以

2、及飲食限制是否可以改善早期營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致的肥胖小鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)的代謝紊亂。
　　方法:本課題建立兩種小鼠模型:1）選取以C57BL/6J為背景的雄性瘦素基因敲除的肥胖小鼠（以下簡(jiǎn)稱(chēng)ob/ob小鼠）作為肥胖模型，同齡正常C57BL/6J雄性小鼠作為對(duì)照，2組小鼠各8-10只，于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)至150 d鼠齡，處死后分離肝組織，固定脫水，石蠟包埋切片，HE染色觀察比較組織形態(tài);抗原F4/80免疫組化染色觀察比較庫(kù)普弗細(xì)胞浸潤(rùn)情況;RN

3、A提取和逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，Q-PCR)檢測(cè)各目的基因mRNA表達(dá)水平;2）通過(guò)調(diào)整母鼠喂養(yǎng)的子鼠數(shù)建立早期營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩模型:子鼠出生后第三天每窩調(diào)整至5只，第六天調(diào)整為3只直至斷乳，作為早期營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩組(chronic postnatal overnutrition，CPO)，對(duì)照組(control，CTR)不調(diào)整子鼠數(shù)量，每窩喂養(yǎng)10-11只。在21天鼠齡斷奶后，兩組均選取雄性

4、小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。在45天鼠齡時(shí)，CPO組小鼠隨機(jī)分為兩組:一組自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料;另一組進(jìn)行飲食干預(yù)，減少其攝食量至原攝食量的2/3(CPO food restriction，CPO-FR)。據(jù)此將子鼠分為三組:CTR，CPO和CPO-FR。
　　三組動(dòng)物在100 d鼠齡時(shí)接受葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucose tolerancetest，GTT)，在120 d鼠齡時(shí)接受丙酮酸耐量實(shí)驗(yàn)(pyruvate tolerancete

5、st，PTT)，以檢測(cè)小鼠糖耐量水平和肝臟糖異生功能變化;動(dòng)物喂養(yǎng)至150 d處死，比較三組小鼠的體質(zhì)量、新鮮肝質(zhì)量和新鮮脂肪質(zhì)量差異;采用H&E染色觀測(cè)肝細(xì)胞形態(tài)、脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)程度;采用透射電子顯微鏡技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的觀察;Q-PCR檢測(cè)各相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平;Western Blot蛋白免疫印跡檢測(cè)肝臟解耦聯(lián)蛋白2(uncoupling protein2，UCP2)、細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cy

6、t-C)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisomeproliferator activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1）150 d鼠齡ob/ob小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量高于對(duì)照組;肝臟組織病理切片HE染色結(jié)果顯示ob/ob小鼠肝組織出現(xiàn)較大程度的肝細(xì)胞脂肪性變;F4/80免疫組化染色結(jié)果顯示ob/ob小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;Q-PCR結(jié)

7、果顯示ob/ob小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α、PPARα、NRF1的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。2）對(duì)早期營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩誘導(dǎo)的肥胖小鼠進(jìn)行飲食限制后，其體重增長(zhǎng)模式與CTR小鼠相似，顯著低于未限制飲食肥胖組;其新鮮肝重和脂肪重明顯低于CPO小鼠。與CTR小鼠相比，CPO小鼠出現(xiàn)代謝紊亂特征，主要表現(xiàn)為:胰島素敏感性降低，肝臟糖異生過(guò)程異常增強(qiáng);肝細(xì)胞脂肪變性，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，包括線粒體結(jié)構(gòu)受損、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等;與線粒體合成和糖脂代謝

8、相關(guān)基因mRNA表達(dá)上調(diào)。對(duì)部分CPO小鼠進(jìn)行飲食限制后，與CPO組小鼠相比，CPO-FR組小鼠表現(xiàn)出:對(duì)胰島素敏感性增強(qiáng);糖異生水平下降;肝臟無(wú)明顯脂質(zhì)沉積，肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)得以改善;涉及線粒體合成和糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平降至對(duì)照組水平。
　　結(jié)論:1）ob/ob小鼠表現(xiàn)肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂質(zhì)沉積，肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn);伴隨上述改變，肝臟能量代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α，PPARα和NRF1的表達(dá)水平增加，三種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的異常增