糖尿病人群及高脂飲食肥胖小鼠的免疫代謝學(xué)研究.pdf

1、第一部分肥胖與自身免疫糖尿病的臨床流行病學(xué)調(diào)查。
　　 目的：研究成人遲發(fā)型自身免疫糖尿病(LADA)在中國初診2型糖尿病患者中的患病率；研究肥胖在自身免疫糖尿病患者中的患病率。
　　 方法：全國46家三級甲等醫(yī)院入組有效新診2型糖尿病患者共計5128例，其中確診LADA患者316例；湖南省各省地市級醫(yī)院入組1型糖尿病患者共計109名；社區(qū)流調(diào)OGTT篩選健康正常對照216；均于當?shù)蒯t(yī)院采集人口學(xué)及一般臨床資料，血清送中

2、南大學(xué)糖尿病中心檢測GADA。
　　 結(jié)果：①5128例新診2型糖尿病患者中，316[6.2％(5.5-6.8)]名患者GADA為陽性，診斷為LADA。②LADA北方患病率高于南方6.9％(156/2256)v.s.5.6％(160/2872)，校正后差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。③患者按15歲為年齡段劃分亞組，GADA的陽性率隨著年齡的增長而降低。校正后，差異仍然具有顯著性(P=0.004)。在15～29歲年齡組，GA

3、DA陽性率最高達11.7％(29/248)，是陽性率最低的45～59歲年齡組[5.0％(110/2207)]的兩倍。④新診的2型糖尿病患者按BMI劃分亞組，體型消瘦的患者GADA陽性率更高(P<0.001)。校正后，差異仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義。⑤新診2型糖尿病患者根據(jù)空腹C肽水平分為胰島β細胞功能差組(<0.3ng/ml)和較好組(≥0.3ng/ml)。胰島功能差組GADA陽性率明顯高于胰島功能較好組[12.6％(39/309)vs.5.4

4、％(80/1479)，P<0.001]，校正后差異仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。⑥2型糖尿病患者中超重及肥胖患者共計2148例，患病率為44.99％；而經(jīng)典1型糖尿病患者中超重及肥胖患者共計8例，約占8.25％；肥胖在LADA患者中發(fā)病率介于1型和2型糖尿病之間，共計108例，約占34.50％，與健康對照患者近似(33.18％)。四組間，或兩兩組間比較各類型體型人群所占比例，P值均小于0.001。⑦男性2型糖尿病患者中，肥胖及超

5、重患者共計1365例，約占47.7％；而在男性1型糖尿病患者中，肥胖及超重患者共計6例，約占9.23％；LADA介于其中，共有73例肥胖或超重患者，約占37.44％，略低于健康對照組的40.14％。四組間，或兩兩組間比較各類型體型人群所占比例，P值均小于0.001。⑧健康對照及2型糖尿病患者中，超重及肥胖患者所占比例隨年齡的增加逐漸降低，而在1型糖尿病患者中逐漸增加。LADA患者中，肥胖及超重患者所占比例先隨增齡而增加，繼之持平。⑨在2

6、型糖尿病及LADA患者中，肥胖組較非肥胖組具有更好的胰島功能。
　　 結(jié)論：LADA在初診2型糖尿病中占6.2％，肥胖及超重患者在LADA中占34.5％，在1型糖尿病患者中占8.25％。從流行病學(xué)角度，2型糖尿病相關(guān)的炎癥(肥胖)及1型糖尿病相關(guān)的自身免疫反應(yīng)(胰島自身抗體)同時存在于同一類型病人。糖尿病可能存在共同的免疫學(xué)機制。
　　 第二部分炎癥及脂肪細胞因子在不同糖尿病人群中的水平及相關(guān)臨床特征研究。
　　

7、 目的：血清細胞因子水平的改變多見于肥胖及2型糖尿病患者，在自身免疫糖尿病中尚未詳盡研究。我們檢測中國糖尿病患者血清炎癥因子或脂肪細胞因子水平以研究其與糖尿病特別是自身免疫糖尿病的關(guān)系。
　　 方法：由來自第一部分研究的多中心人群中選取30歲以上符合入組及排除標準的的健康對照196名，1型糖尿病53名，LADA250名，以及2型糖尿病285名。中心化檢測血清中的hs-CRP，IL-6，LCN2以及Adiponectin水平，并分

8、析相關(guān)臨床特征。
　　 結(jié)果：①與LADA及2型糖尿病患者相比，1型糖尿病患者具有年齡小(40.77±9.89yrs)，體型偏瘦(BMI=21.94±5.19kg/m2)的臨床特征。LADA的胰島功能(fasting insulin：8.9±0.56μUml，F(xiàn)CP：1.51±0.12 vs.1.03±0.10 nmol/l，P<0.01)比2型糖尿病差，而1型糖尿病患者胰島功能(FCP：0.27±0.07 nmol/l)比LA

9、DA及2型糖尿病患者都更差(FCP：1.03±0.10 and1.5±0.12 nmol/l respectively，P<0.01 for each)。②校正后，與正常對照組比較(1.82±0.11 pg/ml)，所有糖尿病組IL-6均升高(T1 DM：3.05±0.50，LADA：3.04±0.24，T2DM：4.03±0.33pg/ml，P<0.01 for each)。同時LCN2在各糖尿病組中(67.01±13.01，65.9

10、8±5.39，81.80±6.10 pg/ml respectively)較正常對照組也增加(28.43±1.22 pg/ml，P<0.01 for each)。③所有四種細胞因子在LADA中(包括hs-CRP2.30±0.14 mg/l以及Adiponectin8.764±0.75 ug/ml)較正常對照組(hs-CRP：1.36±0.12 mg/l，Adiponectin：8.15±0.40 ug/ml，P<0.01 for all

11、)都升高。
　　 結(jié)論：在中國人群中，炎癥標志物在所有三種糖尿病患者中都升高，但是其病因機制可能不盡相同。
　　 第三部分CD11c細胞表達MyD88分子可以正向調(diào)節(jié)高脂誘導(dǎo)肥胖的形成
　　 目的：通過高脂飼養(yǎng)，建立肥胖小鼠模型，比較不同基因型小鼠通過高脂喂養(yǎng)4個月后的肥胖表型。
　　 方法：B6野生型小鼠，B6Myd88-/-小鼠，以及B6CD11cMyd88+/+Myd88-/-小鼠，分為高脂食物飼養(yǎng)

12、組和普通食物飼養(yǎng)組(每組均大于10只)，自6周齡起開始4個月高脂飼養(yǎng)。監(jiān)測小鼠體重，食物消耗量。IPGTT，ITT檢測小鼠葡萄糖及胰島素耐受情況。稱量小鼠附睪脂肪墊重量，全身掃描確定小鼠體脂含量。測定小鼠血清甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白水平。測定小鼠骨密度。
　　 結(jié)果：1)通過高脂飼養(yǎng)小鼠成功建立高脂致肥胖小鼠模型。經(jīng)過4個月高脂食物喂養(yǎng)，野生型小鼠平均體重達到47.35g，而普通飲食組平均體重僅29.60g，P<0.001

13、。2)全身MyD88-/-基因敲除小鼠經(jīng)高脂飼養(yǎng)，體重顯著低于野生型小鼠。高脂飲食MyD88-/-小鼠平均體重為40.64g，輕于B6野生型小鼠(47.35g，P<0.001)。3)B6CD11cMyd88+Myd88-/-小鼠CD11c細胞表達MyD88分子而其他所有組織及細胞均不表達。經(jīng)過高脂飼養(yǎng)4個月，其體重與B6野生型小鼠相似，重于全身MyD88-/-小鼠。4)B6野生型小鼠每周攝取能量遠高于Myd88-/-小鼠。CD11 cM

14、yd88+Myd88-/-小鼠攝取食物能量介于二者之間。
　　 結(jié)論：4個月高脂飼養(yǎng)可以成功建立肥胖小鼠模型。MyD88分子全身敲除有效保護肥胖的形成。CD11c細胞表達MyD88分子可以正向調(diào)節(jié)肥胖的形成。三種小鼠高脂飼養(yǎng)后脂肪分布，葡萄糖耐量及甘油三酯水平具有明顯差異。
　　 第四部分高脂飲食下B6，CD11cMyD88+/+MyD88-/-B6肥胖小鼠免疫學(xué)的研究
　　 目的：比較三種不同基因型小鼠在高脂飼

15、養(yǎng)致肥胖后的脾臟淋巴細胞、脂肪基質(zhì)細胞、骨髓分化樹突狀細胞及腸道淋巴系統(tǒng)的免疫改變。
　　 方法：獲取小鼠的脾臟淋巴細胞、脂肪基質(zhì)細胞、骨髓分化樹突狀細胞及腸道淋巴細胞。通過免疫熒光單克隆抗體進行染色，流式細胞術(shù)測定各類免疫細胞的表型變化。通過細胞內(nèi)因子染色，流式細胞術(shù)測定調(diào)節(jié)性T細胞的變化。通過Luminex檢測平臺，檢測血漿中游離炎癥因子的變化。通過細胞內(nèi)因子染色，流式細胞術(shù)檢測各細胞群細胞因子釋放的變化。通過3H摻入法檢測

16、脾臟淋巴細胞對于CD3，CD40，LPS的刺激的變化。磁珠分離CD11c+細胞，通過與BDC2.5T細胞共培養(yǎng)，3H摻入法測定其抗原提呈功能。
　　 結(jié)果：1)野生型B6小鼠各類免疫細胞所占比例特別是T細胞所占比例均顯著下降。高脂飲食下，脂肪基質(zhì)細胞中的CD4+及CD8+T細胞所占比例減少，而CD11b+及CD11c+細胞所占比例增加。高脂飲食下MyD88-/-小鼠的脾臟淋巴細胞中CD11c及CD11b細胞較其他兩組增加，而在脂

17、肪基質(zhì)細胞中較其他兩組小鼠減少。2)Foxp3調(diào)節(jié)性T細胞以Foxp3+CD25-CD4+細胞為主，F(xiàn)oxp3+CD25+CD4+細胞所占比例小于前者。無論高脂或是普通飲食，淋巴細胞Foxp3+CD25+CD4+在MyD88-/-小鼠中所占比例高于其他兩組小鼠而Foxp3+CD25-CD4+細胞所占比例低于其他兩組小鼠。在脂肪基質(zhì)細胞中，兩類調(diào)節(jié)性T細胞均自B6、MyD88-/-、到CD11c小鼠逐漸增加。3)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠游離炎癥因

18、子較普通飲食小鼠顯著增加。4)高脂飲食下MyD88-/-小鼠在LPS刺激下較其他兩組無明顯增殖。5)純化的CD11c細胞在不同濃度抗原刺激下抗原提呈功能在三組小鼠中有所不同，低濃度時，B6小鼠CD11c細胞具有最好的抗原提呈功能，而高濃度抗原刺激下則低于MyD88-/-及CD11c小鼠。6)MyD88-/-B6小鼠BMDC的抗原提呈功能優(yōu)于B6及CD11cMyD88+/+MyD88-/-小鼠。
　　 結(jié)論：高脂飼養(yǎng)致肥胖小鼠免疫