重組腺病毒介導(dǎo)siCXCR2抑制磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟的作用.pdf

1、背景：
　　人工關(guān)節(jié)置換術(shù)在治療骨性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老年髖關(guān)節(jié)骨折等方面已經(jīng)取得巨大成功，能夠明顯改善病人運(yùn)動(dòng)功能和生活質(zhì)量。磨損顆粒誘導(dǎo)的植體周圍松動(dòng)是全關(guān)節(jié)置換術(shù)病人術(shù)后最常見的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后產(chǎn)生的磨損顆粒及副產(chǎn)物可導(dǎo)致局部的慢性炎癥反應(yīng)和異物反應(yīng)從而刺激破骨細(xì)胞分化成熟造成局部溶骨最終導(dǎo)致無菌松動(dòng)。有效的抑制破骨細(xì)胞過度分化成熟能夠改善全關(guān)節(jié)置換術(shù)成功率及遠(yuǎn)期療效。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，

2、植體周圍局部炎癥反應(yīng)是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟的重要因素之一，且IL-8在破骨細(xì)胞成熟分化中起著重要作用。因此，我們課題組采用腺病毒干擾技術(shù)沉默IL-8的受體CXCR2，針對(duì)IL-8/CXCR2通路研究CXCR2在磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞過度分化成熟中發(fā)揮的作用。
　　目的：
　　體內(nèi)構(gòu)建小鼠顱骨骨溶解模型，觀察siRNA-CXCR2是否具有抑制破骨細(xì)胞分化成熟及局部骨溶解的作用。體外培養(yǎng)原代破骨細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞，觀察siCXCR

3、2是否具有直接和間接調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟的作用。
　　方法：
　　1.體外實(shí)驗(yàn)：
　?。?）建立破骨細(xì)胞株（RAW264.7）培養(yǎng)體系
　　培養(yǎng)破骨細(xì)胞株RAW264.7，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)，觀察破骨細(xì)胞成熟分化刺激因子RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞株 RAW264.7分化過程中對(duì)RAW264.7細(xì)胞表面CXCR2表達(dá)的影響。
　?。?）建立原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系
　　使用 siCXCR2成功轉(zhuǎn)染原代破骨細(xì)胞后

4、，運(yùn)用 Western blot、Real-Time PCR、抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP染色）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白及基因的表達(dá)，及細(xì)胞中 RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(c-FoS，NFATc1，Ctsk)基因的表達(dá)變化。觀察IL-8/CXCR2通路直接調(diào)控破骨細(xì)胞成熟分化的作用。
　　（3）建立原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系
　　使用 siCXCR2成功轉(zhuǎn)染原代成骨細(xì)胞后，運(yùn)用 Western blo

5、t、Real-Time PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞中OPG、RANKL在蛋白水平及基因水平的表達(dá)情況。觀察IL-8/CXCR2通路是否作用于成骨細(xì)胞間接調(diào)控破骨細(xì)胞成熟分化的作用。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　首先構(gòu)建鈦顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨骨溶解模型。運(yùn)用Real-Time PCR、TRAP染色、免疫組織化學(xué)、micro-CT等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)各組模型局部破骨細(xì)胞數(shù)量及局部溶骨情況。觀察siCXCR2在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否具有抑制磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)

6、胞過度成熟分化，有效抑制局部溶骨的作用。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過RANKL刺激后的 RAW264.7破骨細(xì)胞株表面CXCR2表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.通過體外培養(yǎng)原代破骨細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞，觀察到siCXCR2可以直接作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞抑制其向具有溶骨作用成熟破骨細(xì)胞分化，間接作用于成骨細(xì)胞，調(diào)控 OPG、RANKL的表達(dá)從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟。
　　3.在鈦顆粒誘小鼠顱骨骨溶解模型中，通過沉默 CXCR2