非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤DNA含量與EGFR突變檢測關(guān)系的研究.pdf

1、目的：肺癌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的首要原因，嚴(yán)重危害著人類健康。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的80％。目前依據(jù)基因型的靶向治療已經(jīng)成為NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一。臨床應(yīng)用靶向藥物前需要進(jìn)行基因檢測以選擇受益人群。傳統(tǒng)的組織活檢用于突變檢測存在一定的局限性，近年來循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)作為“液體活

2、檢”的檢材備受關(guān)注，大量文獻(xiàn)比較了應(yīng)用組織和ctDNA進(jìn)行突變檢測的一致性，但各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果差異較大，歸結(jié)原因應(yīng)該是血漿ctDNA含量差異造成的。本研究擬通過分析ctDNA含量水平與突變檢測準(zhǔn)確性之間的關(guān)系，確定取得可靠突變檢測結(jié)果時(shí)的ctDNA水平。同時(shí)探討了利用細(xì)胞毒性藥物增加ctDNA含量進(jìn)而提高基因突變檢測正確度的理論可行性。
　　方法：用EGFR T790M突變的人NSCLC細(xì)胞株H1975構(gòu)建裸鼠移植瘤模型36只，自

3、然生長至不同腫瘤大小后，取血提取cfDNA。設(shè)計(jì)4對引物，分別擴(kuò)增長度為81bp、297bp的人LINE-1基因和長度為120bp、338bp的鼠ACTB基因。用Q-PCR方法分別測定來自H1975細(xì)胞的人源ctDNA(以下表示為hctDNA)和來自裸鼠自身的鼠源cfDNA（以下表示為mcfDNA）的含量，以長片段hctDNA（或mcfDNA）含量與短片段hctDNA（或mcfDNA）含量比值作為cfDNA的完整性指數(shù)(DⅡ)。同時(shí)用微

4、滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR T790M突變，分析突變檢測結(jié)果與hctDNA含量和腫瘤重量的關(guān)系。此外，分別將順鉑用于體外培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞株和給荷瘤鼠腹腔灌注順鉑，采用上述方法測定培養(yǎng)基上清和鼠血漿中ctDNA含量，分析化療藥物在體內(nèi)外促進(jìn)ctDNA釋放的規(guī)律。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件。
　　結(jié)果：
　　1.36只荷瘤鼠瘤重為0.06g～2.26g，裸鼠血漿中的hctDNA呈偏態(tài)分布，其含量(ng/ml)表示為中

5、值±四分位距（范圍）:短片段hctDNA含量6.43±25.93(0.37～186.76)，長片段hctDNA含量0.34±0.95(0.01～25.46)，人源DⅡ?yàn)?.040±0.044(0.009～0268)。mcfDNA呈正態(tài)分布，其含量(ng/ml)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（范圍）:短片段mcfDNA含量76.71±34.64(6.41～147.44)，長片段mcfDNA含量28.13±12.01(4.72～46.66)，鼠源DⅡ?yàn)?/p>

6、0.397±0.121(0.187～0.736)。無論是hctDNA還是mcfDNA均以短片段cfDNA含量代表實(shí)際cfDNA含量。hctDNA與mcfDNA含量之比其中值±四分位距（范圍）為0.086±0.406(0.004～3.918)。
　　2.血漿mcfDNA的含量、鼠源DⅡ與腫瘤重量無關(guān)。血漿hctDNA含量與腫瘤的重量呈正相關(guān)，rs=0.85，P＜0.001;人源DⅡ與腫瘤重量呈負(fù)相關(guān)，rs=-0.34，P=0.042

7、。hctDNA與mcfDNA的比值隨腫瘤重量的增加而增大，呈正相關(guān)，rs=0.76，P＜0.001。
　　3.36例樣本中，檢出突變22例，其每毫升血漿突變拷貝數(shù)中值±四分位距（范圍）105.00±231.86(21～4140)，未檢出突變14例。22例檢出突變的陽性樣本中，其腫瘤重量為0.22g～2.26g，hctDNA含量中值±四分位距（范圍）為18.24±39.23(1.40～186.76)，hctDNA與mcfDNA的比值

8、為0.236±0.465(0.039～3.918)。14例未檢出突變的陰性樣本中，其腫瘤重量為0.06g～0.55g，hctDNA含量(ng/ml)范圍2.92±2.91(0.37～16.82)，hctDNA與mcfDNA的比值為0.053±0.058(0.004～0.462)。
　　4.突變檢出陽性樣本中，每毫升血漿突變拷貝數(shù)與腫瘤重量呈正相關(guān)，rs=0.42，P=0.049;同時(shí)，每毫升血漿突變拷貝數(shù)也與hctDNA含量呈正相

9、關(guān)，rs=0.432，P=0.045。突變檢出陽性樣本中其hctDNA含量、腫瘤重量和hctDNA/mcfDNA之比顯著高于突變檢出陰性樣本(P＜0.05)。hctDNA含量≥6ng/ml者突變檢出率為89.47％，hctDNA＜6ng/ml者突變檢出率為29.41％。如以腫瘤重量(0.45g)或hctDNA/mcfDNA之比(0.08)為標(biāo)準(zhǔn)，兩組突變檢出率都分別為84.21％和35.29％。
　　5.順鉑作用于A549、H52

10、0細(xì)胞后，ctDNA在36～48h時(shí)間段內(nèi)釋放量最大，上清液中ctDNA含量達(dá)181～260ng/ml。
　　6.荷A549裸鼠給藥后，其血漿中ctDNA隨給藥時(shí)間而變化，先逐漸上升，峰值出現(xiàn)在給藥后48h，ctDNA含量為416.81±62.25ng/ml，之后下降并趨向于正常水平。
　　結(jié)論：
　　1.mcfDNA含量及鼠源DⅡ與腫瘤大小無關(guān);hctDNA含量與腫瘤大小呈正相關(guān)，人源DⅡ與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)。隨著腫瘤

11、增大，hctDNA的含量增加，完整性下降。表明荷瘤鼠血漿中cfDNA來源于鼠正常細(xì)胞的比較穩(wěn)定，來自腫瘤細(xì)胞的與腫瘤負(fù)荷呈正比。
　　2.以cfDNA為檢材進(jìn)行突變檢測，突變檢出率與腫瘤大小、hctDNA含量呈正相關(guān)，當(dāng)hctDNA含量達(dá)到一定水平時(shí)，突變檢測結(jié)果才可靠。鑒于血漿cfDNA中來自正常細(xì)胞的部分較為穩(wěn)定，在臨床實(shí)際應(yīng)用中可以考慮用總cfDNA含量代替hctDNA作為突變檢測的參考指標(biāo)。
　　3.細(xì)胞毒性藥物可以