2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景與目的
   Scorpions ARMS EGFR基因突變檢測試劑盒,是目前公認(rèn)檢測EGFR基因突變最為敏感的方法之一,其檢測靈敏性可達(dá)10copies,敏感性高達(dá)1%。此外它還具有操作簡便、結(jié)果判讀容易、省時、檢測突變種類多等優(yōu)點(diǎn),但唯一缺點(diǎn)是價格昂貴,不適合象中國這種發(fā)展中國家NSCLC患者的常規(guī)檢測和篩查。因此,本研究擬采用ARMS技術(shù)與Taqman探針楣結(jié)合的方法,研發(fā)一種擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)并且能夠快速、敏感、特

2、異、簡便檢測EGFR基因突變的試劑盒。
   ScorpionsARMS試劑盒ARMS引物設(shè)計是將3’端設(shè)計在突變位點(diǎn),最后一個堿基與突變堿基配對,只有引物3’末端完全配對時,才能正常擴(kuò)增,當(dāng)引物3’末端發(fā)生錯配時,不能有效擴(kuò)增。但是對于替換突變,如T790M,在使用ARMS引物時,由于野生型與突變型只有一個堿基的差別,當(dāng)野生型模板含量高時,可能發(fā)生無效的引物結(jié)合,由此產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,導(dǎo)致檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此,我們擬重新設(shè)

3、計ARMS引物,在引物的3’端再人為引入一個錯配堿基,這樣對野生型模板即有兩個錯配堿基,可大大提高特異性,而對突變型模板只有一個錯配堿基,且不在3’末端,通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選,最終確定與突變模板具有高結(jié)合效率的引物,同時不影響檢測靈敏度。
   方法
   ①采用重疊延伸PCR法聯(lián)合質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建EFGR基因29種常見突變體(包括18外顯子的3種突變G719A、G719S、G719C;19外顯子的19種缺失突變;20外顯

4、子的5種突變T790M、S7681和3種插入突變;21外顯子的2種突變L858R和L861Q,共29種)。
   ②應(yīng)用PrimerExpress3.0軟件設(shè)計EGFR基因29種常見突變的ARMS特異性引物以及用于目的序列檢測的Taqman水解探針,通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選并確定最終的ARMS引物和Taqman探針,并優(yōu)化反應(yīng)體系:建立試劑盒。然后,以所構(gòu)建的基因突變體為研究對象,進(jìn)一步分析該試劑盒的檢測靈敏度、敏感性以及確立特異性和非

5、特異性擴(kuò)增的Cutoff△Ct值。
   ③采用TaqmanARMS試劑盒檢測100份NSCLC組織標(biāo)本。其中有29份標(biāo)本,曾采用ScorpionsARMS試劑盒檢測過EGFR基因突變,通過比較這兩種方法檢測結(jié)果的差異,來評價這兩種方法檢測一致性。
   結(jié)果
   ①采用重疊延伸PCR法能夠?qū)GFR基因?qū)嵤┒c(diǎn)突變,聯(lián)合質(zhì)粒連接和DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠成功重建29種常見的EGFR基因突變體。
  

6、 ②最終篩選和確定的ARMS引物和Taqman探針見第二部分表3。在無野生型基因以及背景DNA干擾的情況下,本試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)10copies。對于檢測敏感性方面,在500copies/ul野生型基因背景下,其敏感性達(dá)1%,即混有1%突變基因即可檢出;在5000copies/ul野生型基因背景下,其敏感性高達(dá)0.1-0.5%。對于檢測特異性方面,以正常人白細(xì)胞DNA(1-50ng/ul)為研究對象,T790M和21L858R突變存

7、在一定程度的非特異性擴(kuò)增,但其最小△CT(CT非特異-CT內(nèi)參)仍分別高達(dá)11.36和14.89,而其他的突變G719X、19Del、20Ins、L861Q、S768I均未見非特異性擴(kuò)增。
   ③100份臨床標(biāo)本,TaqmanARMS試劑盒檢出19Del21例,21L858R18例,20Ins1例.G719X1例,總突變率為41.0%(41/100)。從EGFR基因突變分布看,19Del占51.2%(21/41),21L858

8、R占43.9%(18/41),20Ins占2.4%(1/41),G719X占2.4%(1/41),未檢出T790M突變。其中29份標(biāo)本分別采用了ScorpionsARMS和TaqmanARMS進(jìn)行檢測,兩種方法對19Del突變檢出一致率為93.1%,Kappa值為0.627;對21L858R突變檢出一致率高達(dá)96.6%,Kappa值為0.890,兩種方法具有較高的一致性。
   結(jié)論
   我們所設(shè)計的TaqmanARM

9、S熒光定量PCR試劑盒是一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)以及具有較高靈敏度和特異性的EGFR基因突變檢測方法,值得在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證和推廣。
   第一部分,29種EGFR基因突變體的構(gòu)建
   目的:采用重疊延伸PCR法聯(lián)合質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建EFGR基因29種常見突變體。
   方法:首先,采用重疊延伸PCR法建立EGFR基因常見的29種突變(包括18外顯子的3種突變G719A、G719S、G719C;19外顯子的19種缺

10、失突變;20外顯子的5種突變T790M、S7681和3種插入突變;21外顯子的2種突變L858R和L861Q,共29種);其次,將建立的29種突變型EGFR基因分別與pMD19載體進(jìn)行連接反應(yīng),連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng),然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接種至含Amp的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),白色菌斑表示基因插入成功,藍(lán)色菌斑表示插入不成功;最后,挑選白色單克隆菌斑加入到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),并進(jìn)行PCR鑒定以及測序鑒定以判斷是否成功構(gòu)建

11、EGFR基因突變體。
   結(jié)果:第一輪PCR結(jié)果顯示,每種EGFR基因突變位點(diǎn)上游和下游序列均能有效擴(kuò)增。第二輪PCR結(jié)果顯示,在第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物中,上游序列和下游序列具有互補(bǔ)的末端,它們能以各自為模板進(jìn)行第二輪有效擴(kuò)增。連接、轉(zhuǎn)換以及培養(yǎng)結(jié)果顯示,每種EGFR突變型基因均能成功連接于質(zhì)粒載體pMD19,并在大腸桿菌DH5a中克隆性增殖。PCR以及測序鑒定結(jié)果顯示,EGFR突變基因能夠有效的擴(kuò)增,測序所得的堿基序列與EGFR常

12、見突變序列一致。
   結(jié)論:采用重疊延伸PCR法能夠?qū)GFR基因?qū)嵤┒c(diǎn)突變,聯(lián)合質(zhì)粒連接和DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠成功重建29種常見的EGFR基因突變體。
   第二部分,ARMS熒光定量PCR檢測體系建立
   目的:建立一種由ARMS特異性引物技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合的用于EGFR基因29種突變檢測的實(shí)時PCR反應(yīng)試劑盒。
   方法:應(yīng)用PrimerExpress3.0軟件設(shè)計EGF

13、R基因29種常見突變的ARMS特異性引物以及用于目的序列檢測的Taqman水解探針,通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選并確定最終的ARMS引物和Taqman探針,并優(yōu)化反應(yīng)體系,建立試劑盒。然后,以第一部分所構(gòu)建的基因突變體為研究對象,進(jìn)一步分析該試劑盒的檢測靈敏度、確立特異性和非特異性擴(kuò)增的CutoffAΔCt值以及檢測其最低分辨率,即敏感性。最后,在模擬血漿樣本上,比較直接測序法和我們建立的TaqmanARMS法的敏感性。
   結(jié)果:最終篩

14、選和確定的ARMS引物和Taqman探針見表3。在無野生型基因以及背景DNA干擾的情況下,本試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)10copies。對于檢測特異性方面,以正常人白細(xì)胞DNA為研究對象,濃度范圍為1-50ng/ul,T790M和21L858R突變存在一定程度的非特異性擴(kuò)增,但是其最小△CT(CT非特異-CT內(nèi)參)仍分別高達(dá)11.36和14.89,而其他的突變G719X、19Del、20Ins、L861Q、S7681均未見非特異性擴(kuò)增。在9

15、0份正常人血漿中提取的DNA(1-15ng/ul)進(jìn)行特異性驗(yàn)證的研究顯示,所有突變類型均未見非特異性擴(kuò)增。對于檢測分辨率方面,在500copies/ul野生型基因背景下,其最低檢測分辨率達(dá)高達(dá)1%,即混有1%突變基因即可檢出;在5000copies/ul野生型基因背景下,其最低檢測分辨率高達(dá)0.1-0.5%,即混有0.1-0.5%突變基因即可檢出。在對模擬血清樣本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),PCR測序敏感性在10%以上,而本試劑盒敏感性達(dá)0.5%,

16、遠(yuǎn)高于測序法。
   結(jié)論:本研究所設(shè)計的EGFR基因突變檢測試劑盒具有較高的靈敏度、特異性和敏感性,而且價格便宜,操作時間短,值得臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。
   第三部分ARMS熒光定量PCR法檢測NSCLC組織標(biāo)本EGFR基因突變狀況
   目的:評價第二部分所設(shè)計的ARMS熒光定量PCR試劑盒(Taqman-ARMS)檢測NSCLC組織EGFR基因突變的性能。
   方法:采用TaqmanARMS方法一共檢

17、測組織標(biāo)本100份。其中有29份標(biāo)本,分別采用ScorpionsARMS法和我們的方法Taqman-ARMS進(jìn)行EGFR基因突變檢測,通過比較兩種方法檢測結(jié)果的差異,來評價這兩種方法檢測的一致性,同時對Taqman-ARMS法檢測出存在突變的標(biāo)本進(jìn)行測序驗(yàn)證。另有29份臨床標(biāo)本,分別采用ME-PCR+基因測序法和我們的方法Taqman-ARMS進(jìn)行EGFR基因突變檢測,通過比較兩種方法檢測結(jié)果的差異,來評價這兩種方法檢測的一致性。

18、>   結(jié)果:100份臨床標(biāo)本,TaqmanARMS法檢出19Del21例,21L858R18例,201ns1例,G719X1例,總突變率為41.0%(41/100)。從EGFR基因突變分布看,19Del占51.2%(21/41),21L858R占43.g%(18/41),20Ins占2.4%(1/41),G719X占2.4%(1/41).未檢出T790M突變。
   29例臨床標(biāo)本,ScorpionsARMS法檢出19Del

19、3例、21L858R6例,總突變率為31.0%;Taqman-ARMS法檢出19Del3例、21L858R5例,總突變率為27.6%。對這8例標(biāo)本進(jìn)行測序驗(yàn)證,除1例測序失敗外,其余7例測序結(jié)果與Taqman-ARMS檢測結(jié)果完全一致。兩種方法對19Del突變檢出一致率為93.1%,Kappa值為0.627;對21L858R突變檢出一致率為96.6%,Kappa值為0.890。
   另29份臨床標(biāo)本,ME-PCR+測序法檢出1

20、9Del8例、21L858R8例,總突變率為55.2%;Taqman-ARMS法檢出J9Del9例、21L858R7例、20Ins1例、G719X1例,總突變率為62.1%。兩種方法對19Del突變檢出一致率為96.6%,Kappa值為0.918;對21L858R突變檢出一致率為89.7%,Kappa值為0.732。
   結(jié)論:我們所設(shè)計的TaqmanARMS熒光定量PCR試劑盒是一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)以及具有較高靈敏度和特異性

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