非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變檢測試劑盒的開發(fā).pdf

1、背景與目的
　　 Scorpions ARMS EGFR基因突變檢測試劑盒，是目前公認(rèn)檢測EGFR基因突變最為敏感的方法之一，其檢測靈敏性可達(dá)10copies，敏感性高達(dá)1％。此外它還具有操作簡便、結(jié)果判讀容易、省時、檢測突變種類多等優(yōu)點(diǎn)，但唯一缺點(diǎn)是價格昂貴，不適合象中國這種發(fā)展中國家NSCLC患者的常規(guī)檢測和篩查。因此，本研究擬采用ARMS技術(shù)與Taqman探針楣結(jié)合的方法，研發(fā)一種擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)并且能夠快速、敏感、特

2、異、簡便檢測EGFR基因突變的試劑盒。
　　 ScorpionsARMS試劑盒ARMS引物設(shè)計是將3’端設(shè)計在突變位點(diǎn)，最后一個堿基與突變堿基配對，只有引物3’末端完全配對時，才能正常擴(kuò)增，當(dāng)引物3’末端發(fā)生錯配時，不能有效擴(kuò)增。但是對于替換突變，如T790M，在使用ARMS引物時，由于野生型與突變型只有一個堿基的差別，當(dāng)野生型模板含量高時，可能發(fā)生無效的引物結(jié)合，由此產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，我們擬重新設(shè)

3、計ARMS引物，在引物的3’端再人為引入一個錯配堿基，這樣對野生型模板即有兩個錯配堿基，可大大提高特異性，而對突變型模板只有一個錯配堿基，且不在3’末端，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定與突變模板具有高結(jié)合效率的引物，同時不影響檢測靈敏度。
　　 方法
　　 ①采用重疊延伸PCR法聯(lián)合質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建EFGR基因29種常見突變體（包括18外顯子的3種突變G719A、G719S、G719C;19外顯子的19種缺失突變；20外顯

4、子的5種突變T790M、S7681和3種插入突變；21外顯子的2種突變L858R和L861Q，共29種）。
　　 ②應(yīng)用PrimerExpress3.0軟件設(shè)計EGFR基因29種常見突變的ARMS特異性引物以及用于目的序列檢測的Taqman水解探針，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選并確定最終的ARMS引物和Taqman探針，并優(yōu)化反應(yīng)體系：建立試劑盒。然后，以所構(gòu)建的基因突變體為研究對象，進(jìn)一步分析該試劑盒的檢測靈敏度、敏感性以及確立特異性和非

5、特異性擴(kuò)增的Cutoff△Ct值。
　　 ③采用TaqmanARMS試劑盒檢測100份NSCLC組織標(biāo)本。其中有29份標(biāo)本，曾采用ScorpionsARMS試劑盒檢測過EGFR基因突變，通過比較這兩種方法檢測結(jié)果的差異，來評價這兩種方法檢測一致性。
　　 結(jié)果
　　 ①采用重疊延伸PCR法能夠?qū)GFR基因?qū)嵤┒c(diǎn)突變，聯(lián)合質(zhì)粒連接和DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠成功重建29種常見的EGFR基因突變體。
　　

6、 ②最終篩選和確定的ARMS引物和Taqman探針見第二部分表3。在無野生型基因以及背景DNA干擾的情況下，本試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)10copies。對于檢測敏感性方面，在500copies/ul野生型基因背景下，其敏感性達(dá)1%，即混有1%突變基因即可檢出；在5000copies/ul野生型基因背景下，其敏感性高達(dá)0.1-0.5%。對于檢測特異性方面，以正常人白細(xì)胞DNA(1-50ng/ul)為研究對象，T790M和21L858R突變存

7、在一定程度的非特異性擴(kuò)增，但其最小△CT（CT非特異-CT內(nèi)參）仍分別高達(dá)11.36和14.89，而其他的突變G719X、19Del、20Ins、L861Q、S768I均未見非特異性擴(kuò)增。
　　 ③100份臨床標(biāo)本，TaqmanARMS試劑盒檢出19Del21例，21L858R18例，20Ins1例．G719X1例，總突變率為41.0%(41/100)。從EGFR基因突變分布看，19Del占51.2%(21/41)，21L858

8、R占43.9%(18/41)，20Ins占2.4%(1/41)，G719X占2.4%(1/41)，未檢出T790M突變。其中29份標(biāo)本分別采用了ScorpionsARMS和TaqmanARMS進(jìn)行檢測，兩種方法對19Del突變檢出一致率為93.1%，Kappa值為0.627;對21L858R突變檢出一致率高達(dá)96.6%，Kappa值為0.890，兩種方法具有較高的一致性。
　　 結(jié)論
　　 我們所設(shè)計的TaqmanARM

9、S熒光定量PCR試劑盒是一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)以及具有較高靈敏度和特異性的EGFR基因突變檢測方法，值得在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證和推廣。
　　 第一部分，29種EGFR基因突變體的構(gòu)建
　　 目的：采用重疊延伸PCR法聯(lián)合質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建EFGR基因29種常見突變體。
　　 方法：首先，采用重疊延伸PCR法建立EGFR基因常見的29種突變（包括18外顯子的3種突變G719A、G719S、G719C;19外顯子的19種缺

10、失突變；20外顯子的5種突變T790M、S7681和3種插入突變；21外顯子的2種突變L858R和L861Q，共29種）；其次，將建立的29種突變型EGFR基因分別與pMD19載體進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接種至含Amp的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，白色菌斑表示基因插入成功，藍(lán)色菌斑表示插入不成功；最后，挑選白色單克隆菌斑加入到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR鑒定以及測序鑒定以判斷是否成功構(gòu)建

11、EGFR基因突變體。
　　 結(jié)果：第一輪PCR結(jié)果顯示，每種EGFR基因突變位點(diǎn)上游和下游序列均能有效擴(kuò)增。第二輪PCR結(jié)果顯示，在第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物中，上游序列和下游序列具有互補(bǔ)的末端，它們能以各自為模板進(jìn)行第二輪有效擴(kuò)增。連接、轉(zhuǎn)換以及培養(yǎng)結(jié)果顯示，每種EGFR突變型基因均能成功連接于質(zhì)粒載體pMD19,并在大腸桿菌DH5a中克隆性增殖。PCR以及測序鑒定結(jié)果顯示，EGFR突變基因能夠有效的擴(kuò)增，測序所得的堿基序列與EGFR常

12、見突變序列一致。
　　 結(jié)論：采用重疊延伸PCR法能夠?qū)GFR基因?qū)嵤┒c(diǎn)突變，聯(lián)合質(zhì)粒連接和DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠成功重建29種常見的EGFR基因突變體。
　　 第二部分，ARMS熒光定量PCR檢測體系建立
　　 目的：建立一種由ARMS特異性引物技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合的用于EGFR基因29種突變檢測的實(shí)時PCR反應(yīng)試劑盒。
　　 方法：應(yīng)用PrimerExpress3.0軟件設(shè)計EGF

13、R基因29種常見突變的ARMS特異性引物以及用于目的序列檢測的Taqman水解探針，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選并確定最終的ARMS引物和Taqman探針，并優(yōu)化反應(yīng)體系，建立試劑盒。然后，以第一部分所構(gòu)建的基因突變體為研究對象，進(jìn)一步分析該試劑盒的檢測靈敏度、確立特異性和非特異性擴(kuò)增的CutoffAΔCt值以及檢測其最低分辨率，即敏感性。最后，在模擬血漿樣本上，比較直接測序法和我們建立的TaqmanARMS法的敏感性。
　　 結(jié)果：最終篩

14、選和確定的ARMS引物和Taqman探針見表3。在無野生型基因以及背景DNA干擾的情況下，本試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)10copies。對于檢測特異性方面，以正常人白細(xì)胞DNA為研究對象，濃度范圍為1-50ng/ul，T790M和21L858R突變存在一定程度的非特異性擴(kuò)增，但是其最小△CT（CT非特異-CT內(nèi)參）仍分別高達(dá)11.36和14.89,而其他的突變G719X、19Del、20Ins、L861Q、S7681均未見非特異性擴(kuò)增。在9

15、0份正常人血漿中提取的DNA(1-15ng/ul)進(jìn)行特異性驗(yàn)證的研究顯示，所有突變類型均未見非特異性擴(kuò)增。對于檢測分辨率方面，在500copies/ul野生型基因背景下，其最低檢測分辨率達(dá)高達(dá)1%，即混有1%突變基因即可檢出；在5000copies/ul野生型基因背景下，其最低檢測分辨率高達(dá)0.1-0.5%，即混有0.1-0.5%突變基因即可檢出。在對模擬血清樣本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PCR測序敏感性在10%以上，而本試劑盒敏感性達(dá)0.5%，

16、遠(yuǎn)高于測序法。
　　 結(jié)論：本研究所設(shè)計的EGFR基因突變檢測試劑盒具有較高的靈敏度、特異性和敏感性，而且價格便宜，操作時間短，值得臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 第三部分ARMS熒光定量PCR法檢測NSCLC組織標(biāo)本EGFR基因突變狀況
　　 目的：評價第二部分所設(shè)計的ARMS熒光定量PCR試劑盒(Taqman-ARMS)檢測NSCLC組織EGFR基因突變的性能。
　　 方法：采用TaqmanARMS方法一共檢

17、測組織標(biāo)本100份。其中有29份標(biāo)本，分別采用ScorpionsARMS法和我們的方法Taqman-ARMS進(jìn)行EGFR基因突變檢測，通過比較兩種方法檢測結(jié)果的差異，來評價這兩種方法檢測的一致性，同時對Taqman-ARMS法檢測出存在突變的標(biāo)本進(jìn)行測序驗(yàn)證。另有29份臨床標(biāo)本，分別采用ME-PCR+基因測序法和我們的方法Taqman-ARMS進(jìn)行EGFR基因突變檢測，通過比較兩種方法檢測結(jié)果的差異，來評價這兩種方法檢測的一致性。

18、>　　 結(jié)果：100份臨床標(biāo)本，TaqmanARMS法檢出19Del21例，21L858R18例，201ns1例，G719X1例，總突變率為41.0%(41/100)。從EGFR基因突變分布看，19Del占51.2%(21/41)，21L858R占43.g%(18/41)，20Ins占2.4%(1/41)，G719X占2.4%(1/41)．未檢出T790M突變。
　　 29例臨床標(biāo)本，ScorpionsARMS法檢出19Del

19、3例、21L858R6例，總突變率為31.0%;Taqman-ARMS法檢出19Del3例、21L858R5例，總突變率為27.6%。對這8例標(biāo)本進(jìn)行測序驗(yàn)證，除1例測序失敗外，其余7例測序結(jié)果與Taqman-ARMS檢測結(jié)果完全一致。兩種方法對19Del突變檢出一致率為93.1%，Kappa值為0.627;對21L858R突變檢出一致率為96.6%，Kappa值為0.890。
　　 另29份臨床標(biāo)本，ME-PCR+測序法檢出1

20、9Del8例、21L858R8例，總突變率為55.2%;Taqman-ARMS法檢出J9Del9例、21L858R7例、20Ins1例、G719X1例，總突變率為62.1%。兩種方法對19Del突變檢出一致率為96.6%，Kappa值為0.918;對21L858R突變檢出一致率為89.7%，Kappa值為0.732。
　　 結(jié)論：我們所設(shè)計的TaqmanARMS熒光定量PCR試劑盒是一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)以及具有較高靈敏度和特異性