家蠶細(xì)胞中RISC復(fù)合物結(jié)合小RNA的分離、鑒定與分析.pdf

1、RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC，RNA-induced silencing complex）是一類復(fù)合體效應(yīng)器，介導(dǎo)RNA沉默，主要由小RNA和Argonaute(AGO)蛋白組成。AGO是其核心催化元件。小RNA是一類非編碼RNA分子，在生物體內(nèi)的種類很多，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。在特殊的環(huán)境或壓力作用下，能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種小RNA，并通過與mRNA靶標(biāo)的堿基配對(duì)影響蛋白翻譯或mRNA的穩(wěn)定性[1]。
　　 我

2、們將Bombxy mori argonaute 2（BmAGO2）基因克隆到pIEx-1昆蟲表達(dá)載體中，利用pIEx-1自身的ScaⅠ酶切位點(diǎn)和轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb融合后成功和bamcid重組獲得表達(dá)BmAGO2蛋白的重組病毒iel-bacmid-BmAGO2。本系統(tǒng)中蛋白的表達(dá)采用桿狀病毒極早期基因iel的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，iel啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)在細(xì)胞感染病毒后的9小時(shí)就能檢測(cè)到蛋白的表達(dá)，在17小時(shí)已經(jīng)獲得高效表達(dá)，MTT法

3、檢測(cè)細(xì)胞活力基本正常，可進(jìn)行AGO蛋白結(jié)合小RNA的分離。
　　 重組病毒iel-bacmid-BmAGO2侵染BmN細(xì)胞，在早期開始表達(dá)BmAGO2蛋白,利用His單抗（鼠IgG作陰性對(duì)照）免疫共沉淀HIS-BmAGO2蛋白，Westetrn blotting在His單抗免疫共沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)到HIS-BmAGO2蛋白，而在鼠IgG免疫共沉淀產(chǎn)物中沒有檢測(cè)到HIS-BmAGO2蛋白。提取的免疫共沉淀產(chǎn)物RNA與BmN總RNA相比

4、，免疫共沉淀分離出的小RNA在18bp～50bp有較高的富集，在這段區(qū)域內(nèi)，片段長(zhǎng)度約為20nt、27nt和33nt的條帶尤為明顯;陰性對(duì)照IgG免疫共沉淀分離RNA中沒有看到RNA條帶。
　　 高通量測(cè)序法測(cè)定對(duì)免疫共沉淀產(chǎn)物提取出的小RNA進(jìn)行測(cè)序，陰性對(duì)照結(jié)合RNA含量少，不符合測(cè)序要求。測(cè)序結(jié)果顯示獲得11，691，441條小RNA序列，包含813，702條特異性序列，單條特異性序列的豐度高達(dá)5，731，905，低至1。

5、這些序列來源沒有染色體偏好性;分析獲得的相關(guān)小RNA的長(zhǎng)度分布圖，顯示三個(gè)峰值分別在20nt、27nt和33nt，此結(jié)果與RNA電泳分析結(jié)果一致。對(duì)特異性序列進(jìn)行分析時(shí)，長(zhǎng)度為32nt和33nt序列明顯減少，但長(zhǎng)度為20nt和27nt小RNA包含大量不同低豐度序列，而且，這些序列5'首個(gè)核苷酸序列對(duì)“U”有強(qiáng)烈的偏好性，第10位對(duì)“A”有偏好性，顯示piRNA的特征。通過生物信息學(xué)分析顯示測(cè)出的小RNA種類豐富，包括tRNA-，tran

6、sposable element(TE)-，rRNA-，snoRNA-，snRNA-derivedsmallRNAs，miRNAs和piRNAs。在與BmAGO2蛋白結(jié)合的小RNA中tRNA來源小RNA(tRFs)豐度極高。Northern blotting驗(yàn)證了tRFs和rRNA來源的小RNA，tRFs主要來源于tRNA的5'或3'末端序列，且通過對(duì)反密碼子環(huán)區(qū)、D環(huán)區(qū)和TψC環(huán)區(qū)特異性剪切產(chǎn)生，令人感興趣的是tRFs具有明顯的病毒感