亞溶破補體攻膜復(fù)合物對小膠質(zhì)細胞刺激效應(yīng)的研究.pdf

1、背景： 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)由于免疫抑制微環(huán)境和血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)[1]這兩道天然屏障的的存在，成為機體組織中的免疫赦免區(qū)，但事實上CNS內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定仍需依靠天然免疫系統(tǒng)的長期監(jiān)視和保護；其中，CNS內(nèi)免疫活性最強的小膠質(zhì)細胞和腦組織自身局部產(chǎn)生的補體系統(tǒng)，作為天然免疫的重要成分，是CNS內(nèi)重要的防御力量，若它們的的代謝及功能出現(xiàn)紊亂則會導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境

2、失衡，炎癥爆發(fā)，大量炎細胞激活、炎癥因子釋放等，對自身正常組織產(chǎn)生“旁觀殺傷效應(yīng)”[2，3]。 大量研究顯示：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種臨床表現(xiàn)為進行性記憶和后天獲得性知識不可逆性損失的漸進性神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病的始動因素是細胞外大量的淀粉樣蛋白Aβ(β-amyloid)的沉積，從而促發(fā)了小膠質(zhì)細胞和補體系統(tǒng)的活化失控及功能異常，炎癥因子大量釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)、膽堿能神經(jīng)元喪失，自

3、身神經(jīng)組織受到損害。AD是一種自身毒性改變而非自身免疫性損傷，炎癥反應(yīng)在其中起到了關(guān)鍵的作用[4]。 目前認為，小膠質(zhì)細胞是CNS內(nèi)最主要的免疫活性細胞，它既可表現(xiàn)為骨髓源單核細胞系統(tǒng)的吞噬活性，又可表現(xiàn)出活化后的致炎效應(yīng)。研究證實，AD病變早期，活化小膠質(zhì)細胞可對Aβ產(chǎn)生吞噬作用，但隨著炎癥的發(fā)展，大量沉積的Aβ不斷刺激小膠質(zhì)細胞活化，使其功能紊亂代謝失衡，對Aβ的吞噬減少，同時分泌大量炎性介質(zhì)和氧自由基，上調(diào)表達多種免疫分子

4、，對神經(jīng)組織造成損傷并促進炎癥的進一步加深[5]。 補體系統(tǒng)是CNS內(nèi)重要的天然免疫防御系統(tǒng)，當(dāng)病原微生物或炎性介質(zhì)存在時可被激活最終通過末端成分組裝成C5b-9(n)膜攻擊復(fù)合物(membraneattackcomplex，MAC)。C5b-9(n)是CNS炎癥過程中一種多效免疫因子，在補體大量活化后，可插入細胞膜導(dǎo)致細胞溶解死亡，而近年來新的研究發(fā)現(xiàn)，非致死劑量的MAC可沉積于中基、類脂質(zhì)等炎性介質(zhì)，并誘導(dǎo)細胞因子、黏附分子

5、以及其它功能蛋白的表達等，Morgan.B.P將這些效應(yīng)統(tǒng)稱為MAC的亞溶破刺激效應(yīng)(sublylticeffects)。在對CNS中亞溶破MAC的研究中又發(fā)現(xiàn)，sMAC可抑制少突膠質(zhì)細胞凋亡并增強細胞的有絲分裂[6]，說明sMAC對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護效應(yīng)。 AD病變中，Aβ能通過經(jīng)典和旁路雙途徑激活補體，生成多種炎性片段并最終形成MAC[7]，免疫組化也證實，AD腦中退變的神經(jīng)元和活化的小膠質(zhì)細胞周圍有較多MAC沉積[8]。那么

6、，AD腦中補體活化后形成的亞溶破MAC是否可對CNS炎癥中起關(guān)鍵作用的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生刺激效應(yīng)以及其能否影響小膠質(zhì)細胞對吞噬Aβ的作用至今未見相關(guān)文獻報道。 基于以上分析，本研究擬通過在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞上組裝亞溶破補體攻膜復(fù)合物(sublyticmembraneattackcomplex,sMAC)，觀察sMAC對小膠質(zhì)細胞的亞溶破刺激效應(yīng)，并檢測其對小膠質(zhì)細胞Aβ吞噬功能的影響。為進一步深入探討sMAC和小膠質(zhì)細胞在A

7、D中的發(fā)病機制提供新的實驗資料依據(jù)。 方法： 1.用酵母多糖激活急性期病人血清提取補體優(yōu)球蛋白C56，瓊脂糖平板擴散法及微量板孔法判定活化樣品補體C56活性，分離及提純C56；梯度稀釋提純優(yōu)球蛋白，以新鮮正常人血清(NHS)作為C7～C9來源，微量溶血法滴定C56，觀察不同稀釋度對豚鼠紅細胞的溶血活性。 2.分離新生小鼠大腦皮層的小膠質(zhì)細胞，根據(jù)細胞生長狀態(tài)、形態(tài)特征及細胞免疫化學(xué)法檢測細胞膜上特異性抗原(CD1

8、1b)鑒定分離細胞的純度。于小膠質(zhì)細胞表面組裝sMAC，反應(yīng)性溶破試驗確立亞溶破劑量，激光共聚焦顯微鏡(Laserconfocalmicroscopy,LSCM)間接免疫熒光法驗證sMAC的沉積，流式細胞技術(shù)(FACS)觀測小膠質(zhì)細胞清除sMAC的動力學(xué)變化。 3.顯微鏡觀察sMAC刺激小膠質(zhì)細胞24h后細胞形態(tài)變化；脫落細胞計數(shù)及臺盼蘭拒染法檢測細胞存活率，分別判定細胞黏附力及細胞活力的改變；Griess法和ELISA法分別檢

9、測不同劑量sMAC刺激細胞24h及以固定劑量sMAC刺激細胞不同時相點后上清NO2-、TNF-α分泌變化，RP-PCR、FACS檢測免疫共刺激分子CD40表達變化。將sMAC與Aβ共同刺激小膠質(zhì)細胞，觀測NO2-、TNF-α分泌及CD40表達改變。 4.用Cy3標記的Aβ(1-42)與sMAC和小膠質(zhì)細胞進行吞噬實驗，免疫熒光檢測sMAC對小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ的影響。 結(jié)果： 1.活化后急性期血清20％～30％有溶

10、血活性，分離提純的補體優(yōu)球蛋白C56能與NHS中C7-C9補體終末成分體外正確組裝MAC，其溶血活性與劑量呈依賴關(guān)系。 2.確立小膠質(zhì)細胞亞溶破劑量為C561∶240，1mmol/LEDTA-1∶40NHS；在該劑量刺激下，sMAC可在小膠質(zhì)細胞膜表面大量沉積且細胞膜完整性好。sMAC在小膠質(zhì)細胞上0℃組裝，37℃復(fù)蘇后，表面抗原逐漸減少至消失，sMAC逐漸被小膠質(zhì)細胞清除，半衰期約為6-7分鐘。 3.sMAC刺激后小膠

11、質(zhì)細胞形態(tài)增大至阿米巴樣，胞體鋪展伸出偽足，顆粒分泌增加；細胞黏附力下降脫落明顯但活力未受影響；上清液中NO2-及TNF-α分泌增加，細胞膜表面共刺激分子CD40表達上調(diào)，且與sMAC劑量及刺激時間呈正相關(guān)。將sMAC與Aβ共同作用后，小膠質(zhì)細胞NO2-、TNF-α的分泌及CD40的表達進一步增加。 4.sMAC刺激后小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ的功能增強。 結(jié)論： 本研究通過提取補體優(yōu)球蛋白C56于體外成功組裝了小膠質(zhì)細