ROCK對PDGF誘導(dǎo)大鼠血管乎滑肌細(xì)胞MMP-2、MMP-9及MEF2A表達(dá)的初探.pdf

1、目的:
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)的表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移是動脈粥樣硬化發(fā)病的關(guān)鍵因素。血小板源性生長因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)是一種較強(qiáng)的促有絲分裂劑和化學(xué)趨化劑，在正常動脈中無表達(dá)，當(dāng)血管受損深達(dá)中膜時，其被大量分泌，釋放入血，與其受體結(jié)

2、合，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞由中層向內(nèi)層的遷移。Rho激酶(Rhoassociatedkinase，ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為與功能，如細(xì)胞遷移，細(xì)胞增殖，細(xì)胞粘附，細(xì)胞骨架重組以及其他炎癥反應(yīng)等。ROCK有兩種亞型，ROCKⅠ和ROCKⅡ。本實驗室前期研究顯示:ROCKⅠ在血管平滑機(jī)細(xì)胞的遷移中起主導(dǎo)作用，而ROCKⅡ?qū)w移影響不明顯。伴隨著血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，有大量的細(xì)胞因子表達(dá)。其中，基質(zhì)金屬蛋

3、白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)是一組鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，由VSMC、巨噬細(xì)胞及其他一些細(xì)胞產(chǎn)生，可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)，為血管平滑肌細(xì)胞的遷移掃清道路。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(myocyteenhancer-bindingfactor2，MEF2A)是一類DNA結(jié)合蛋白，有調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化，調(diào)控VSMC增殖的作用。本文旨在研究PDGF刺激下，ROCKⅠ/R

4、OCKⅡ?qū)Υ笫笮刂鲃用}血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)中MMP-2、MMP-9和MEF2A表達(dá)的影響，及ROCKⅠ和ROCKⅡ兩種亞型之間的功能差異，進(jìn)一步探討血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的分子機(jī)制。為研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及診斷預(yù)防提供新的思路，相關(guān)分子信號機(jī)制的研究為藥物尋找靶點奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)利用明膠酶譜法檢測PDGF對大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)、人動脈血管平滑肌細(xì)胞(Aos)、豚鼠

5、腦基底動脈血管平滑肌細(xì)胞(Gba)、兔血管平滑肌細(xì)胞(SM3)中MMP-2、MMP-9活性的影響;(2)用10ng/mlPDGF刺激VSMC3h、6h、12h、24h后分別提取RNA，利用RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9及MEF2A在mRNA水平的表達(dá);(3)采用RNA干擾技術(shù)，分別使ROCKⅠ/ROCKⅡ表達(dá)下調(diào)以及同時下調(diào)ROCKⅠ/ROCKⅡ，利用RT-PCR、WesternBlot檢測基因下調(diào)后細(xì)胞內(nèi)MMP-9和MEF2A

6、在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化。利用ROCK抑制劑Y-27632檢測MMP-9和MEF2A的表達(dá);(4)構(gòu)建ROCKⅠ、ROCKⅡ過表達(dá)質(zhì)粒，載體為pMD19-TSimpleVector，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，利用RT-PCR檢測基因過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9和MEF2A在mRNA水平表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)明膠酶譜結(jié)果顯示，在大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)、人動脈血管平滑肌細(xì)胞(Aos)、豚鼠

7、腦基底動脈血管平滑肌細(xì)胞(Gba)中，10ng/mlPDGF刺激后MMP-2活性明顯增強(qiáng)，而兔血管平滑肌細(xì)胞(SM3)中不明顯。(2)RT-RCR結(jié)果表明PDGF促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)中MMP-2、MMP-9及MEF2A的表達(dá)，且呈現(xiàn)時間效應(yīng)關(guān)系，在12小時時達(dá)到峰值。(3)siRNA轉(zhuǎn)染后，ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)明顯下調(diào)，其中ROCKⅠ表達(dá)下調(diào)了77.3％，ROCKⅡ表達(dá)下調(diào)了91.7％;在siRNA瞬時轉(zhuǎn)染和抑制劑Y-2

8、7632作用下，ROCKⅠ和ROCKⅡ均抑制了PDGF誘導(dǎo)的MMP-9和MEF2A的表達(dá)，兩種亞型對MMP-9的作用無明顯差別，而ROCKⅡ?qū)EF2A的抑制作用相對顯著。(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ROCKⅠ/ROCKⅡ過表達(dá)質(zhì)粒;上調(diào)ROCKⅠ/ROCKⅡ基因表達(dá)后，ROCKⅠ/ROCKⅡ均促進(jìn)MMP-2、MMP-9和MEF2A的表達(dá)，兩種亞型之間無明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 (1)ROCKⅠ和ROCKⅡ?qū)DGF誘導(dǎo)的血管平