miR-let-7a通過(guò)降低PKM2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷徙和轉(zhuǎn)移.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)死亡率第三位的惡性腫瘤。中國(guó)是世界上胃癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，其病死率居惡性腫瘤的第三位，嚴(yán)重威脅人類的生命與健康。正常分化的細(xì)胞主要通過(guò)有氧氧化功能，與之相比，腫瘤細(xì)胞以有氧糖酵解作為主要的供能方式（瓦伯格效應(yīng)）。
　　丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是催化糖酵解最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，它將磷酸烯醇式丙酮酸分解成為丙酮酸。PK在體內(nèi)有四種活性形式，其中PKL和PKR由同一基因PKLR編碼，通過(guò)不同

2、的組織特異性啟動(dòng)子分別表達(dá)于肝臟和紅細(xì)胞中。而PKM1主要表達(dá)于骨骼肌和腦組織，PKM2主要表達(dá)于胚胎組織及增殖的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞中。PKM2主要以2種形式存在，即高活性的四聚體形式和低活性的二聚體形式。四聚體型存在于分化的組織和正常增殖的細(xì)胞中，而二聚體型存在于腫瘤細(xì)胞中，與底物親和力低，促使腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖代謝中間體如磷酸烯醇類物質(zhì)等累積，它將糖酵解途徑阻斷在丙酮酸上游，使中間產(chǎn)物聚集，促進(jìn)大分子物質(zhì)合成，有利于腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞

3、的增殖及血管新生具有重要作用。
　　miR-let-7a是早期發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，也是線蟲時(shí)序性發(fā)育的關(guān)鍵性調(diào)控因子，其不僅在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡，也在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，對(duì)包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤都有抑制作用。我們擬通過(guò)從let-7a入手，分析其在胃癌細(xì)胞中與PKM2可能的作用機(jī)制，研究let-7a/PKM2通路參與胃癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　目的：
　　明確let-7a和PKM2在胃癌

4、組織及細(xì)胞中的表達(dá)差異及相關(guān)性，重點(diǎn)探討let-7a調(diào)控PKM2對(duì)胃癌細(xì)胞株增殖、遷徙和轉(zhuǎn)移能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制，分析let-7a/PKM2通路在胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，其結(jié)果將有助于進(jìn)一步了解let-7a/PKM2信號(hào)通路在胃癌生長(zhǎng)過(guò)程中的作用和分子機(jī)制，對(duì)探索非編碼RNA在胃癌發(fā)病機(jī)制與信號(hào)通路的交互調(diào)控作用有重要意義，可能為未來(lái)胃癌分子治療提供新思路。
　　方法：
　　1、在人類胃癌組織和癌旁組織以及胃癌細(xì)胞株中測(cè)定

5、let-7a和PKM2表達(dá)水平，并進(jìn)行病理特征分析。
　　2、分別構(gòu)建let-7a過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，收獲重組慢病毒感染胃癌細(xì)胞株。實(shí)時(shí)定量PCR、western blot明確let-7a的過(guò)表達(dá)和干擾后，下游c-Myc，hnRNPA1和PKM2的含量變化，CCK-8，Transwell遷徙和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)let-7a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3、分別構(gòu)建PKM2過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，收

6、獲重組慢病毒干擾胃癌細(xì)胞株。
　　4、實(shí)時(shí)定量PCR、western blot明確PKM2的過(guò)表達(dá)和干擾后，上游let-7a，c-Myc和hnRNPA1的含量變化，CCK-8，Transwell遷徙和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PKM2對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　5、裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證let-7a/PKM2通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1、胃癌組織和胃癌細(xì)胞中l(wèi)et-7a表

7、達(dá)與PKM2表達(dá)呈負(fù)相關(guān);
　　2、let-7a通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc，hnRNPA1的表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞中PKM2表達(dá);
　　3、let-7a抑制胃癌細(xì)胞增殖以及遷徙轉(zhuǎn)移能力;
　　4、let-7a最終是通過(guò)影響PKM2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力;
　　5、裸鼠實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)水平證實(shí)let-7a/PKM2通路對(duì)胃癌生長(zhǎng)能力的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　Let-7a通過(guò)影響c-Myc和hnRNPA1