TNF-α-NF-κB-CD38-cADPR信號通路對肥胖型過敏性哮喘小鼠氣道反應(yīng)性的調(diào)控研究.pdf

1、本文分以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 肥胖型過敏性哮喘小鼠模型的制備及肥胖對過敏性哮喘氣道炎癥的影響
　　目的：
　　探索建立肥胖型過敏性哮喘小鼠模型，觀察肥胖對過敏性哮喘小鼠氣道炎癥的影響。
　　方法：
　　80只雌雄各半的SPF級3周齡斷乳C57/B6J小鼠分別隨機分為8組，每組各10只。正常對照組進行普通飼料喂養(yǎng)+生理鹽水致敏激發(fā)，肥胖組予以高脂飼料喂養(yǎng)+生理鹽水致敏激發(fā)，哮喘組進行普通飼料喂養(yǎng)

2、+OVA/Al(OH)3致敏激發(fā)，肥胖型過敏性哮喘組則給予高脂飼料喂養(yǎng)+OVA/Al(OH)3致敏激發(fā)。在喂養(yǎng)過程中每4周測量一次體重，最后在末次激發(fā)24h內(nèi)處死小鼠，測量體長、稱取肝重，計算Lee's指數(shù);光鏡下觀察肺組織病理改變;BALF沉渣涂片作細胞總數(shù)和分類計數(shù);ELISA法檢測血清和BALF上清液中IL-5、IL-13、IFNγ的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.體重:雌鼠體重在高脂飼料喂養(yǎng)的前4周增長迅速，高脂飼料

3、喂養(yǎng)組平均體重超過普通飼料喂養(yǎng)組平均體重的20％，達到肥胖標準，但隨著喂養(yǎng)時間的延長，高脂飼料喂養(yǎng)組的體重上升趨勢逐漸下降，至喂養(yǎng)第12周，高脂飼料喂養(yǎng)組和普通飼料喂養(yǎng)組平均體重之間的差異已無統(tǒng)計學意義;而雄鼠各組體重在喂養(yǎng)的前4周增長較平均，在喂養(yǎng)第8周開始出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)，高脂飼料組平均體重超過普通飼料喂養(yǎng)組的20％，達到肥胖標準，在喂養(yǎng)第12周，體重的差異更加顯著(P＜0.01)。
　　2.肝重和Lee's指數(shù)

4、:雌鼠各組之間肝重和Lee's指數(shù)的改變均無顯著性差異;而雄鼠肥胖組和肥胖型過敏性哮喘組與正常體重組和哮喘組相比肝重和Lee's指數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)。
　　3.光鏡:雌鼠和雄鼠各組之間肺組織病理改變相似，肥胖組HE染色切片示血管周圍有較多炎癥細胞浸潤，而支氣管周圍炎細胞浸潤較哮喘組和肥胖型過敏性哮喘組少，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)，其炎癥細胞評分中位數(shù)(M)雌鼠和雄鼠分別為1.5和2分;哮喘

5、組和肥胖型過敏性哮喘組支氣管管壁周圍有大量炎癥細胞浸潤，常聚集成團，其炎癥細胞評分中位數(shù)(M)均為4分，均分別較正常體重組顯著增高（均P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.C57/B6J雄鼠和雌鼠均可建立肥胖型過敏性哮喘模型，但雄鼠模型較雌鼠更為穩(wěn)定。
　　2.過敏性氣道炎癥并不是連接肥胖和過敏性哮喘發(fā)病機制的橋梁。
　　第二部分 TNF-α-CD38信號通路對肥胖小鼠ASMC收縮功能的影響
　　目的：

6、r>　　闡明TNF-α可通過誘導(dǎo)CD38信號通路的激活改變肥胖小鼠氣道平滑肌細胞中鈣穩(wěn)態(tài)，引起肥胖小鼠氣道平滑肌細胞收縮增強，導(dǎo)致AHR。
　　方法：
　　應(yīng)用Ⅰ型膠原酶消化法原代分離培養(yǎng)正常體重組和肥胖組小鼠氣道平滑肌細胞，并應(yīng)用免疫細胞熒光化學法鑒定;根據(jù)不同的干預(yù)措施分為正常體重組（不加任何干預(yù)）、肥胖組（不加任何干預(yù)）、肥胖CD38 siRNA組(轉(zhuǎn)染CD38 siRNA)、肥胖陽性對照組(轉(zhuǎn)染NAPDH siRNA

7、)和肥胖陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA），各組在干預(yù)前均加入小鼠重組TNF-α刺激12h。采用熒光定量PCR法和流式細胞術(shù)檢測各組小鼠氣道平滑肌細胞表面CD38分子mRNA和蛋白的表達情況，免疫熒光染色測定各組小鼠氣道平滑肌細胞中鈣離子的含量。
　　結(jié)果：
　　1.ASMC的生長情況及鑒定:酶消化法分離的ASMC生長迅速，三代ASMC純度可以達到95％以上。運用熒光法對平滑肌細胞α-肌動蛋白(α-SMA)進行免疫細胞化學

8、染色，95％以上細胞染色結(jié)果為陽性，凍存后復(fù)蘇細胞活力良好。
　　2.熒光定量PCR法檢測CD38 mRNA的表達:肥胖組（未加任何干預(yù)）中CD38mRNA的表達較正常體重組顯著增高，超過正常體重組的3倍(3.599±0.076)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，肥胖陰性對照組中CD38 mRNA的表達與肥胖組相似，但較正常體重組顯著增多(3.663±0.048)，差異有顯著性意義(P＜0.01)，肥胖陽性對照組(NADPH s

9、iRNA)中CD38 mRNA的相對表達量(4.651±0.070)最高，與其他各組相比均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），肥胖CD38 siRNA組中CD38 mRNA的相對表達量(1.528±0.044)顯著低于肥胖組，但仍高于正常體重組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)。
　　3.流式細胞術(shù)檢測CD38蛋白的表達:正常體重組中CD38蛋白的表達水平[(26.86±0.52)％]顯著低于肥胖組[(98.37±0.28)％]，

10、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，肥胖CD38 siRNA組中CD38蛋白的表達水平[(32.82±0.92)％]與肥胖組、肥胖陰性組和肥胖陽性組相比顯著降低，但仍高于正常體重組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，肥胖組、肥胖陰性組和肥胖陽性組之間無顯著性差異。
　　4.ASMC中游離鈣離子的含量:正常體重組整合光密度(ID)為673.65±2.82，顯著低于肥胖組(1241.03±14.71)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)

11、，肥胖CD38siRNA組ID值(735.22±2.83)較肥胖組、肥胖陰性對照組和肥胖陽性對照組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），肥胖組、肥胖陰性對照組(1186.66±29.14)和肥胖陽性對照組(1196.88±21.95)之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　肥胖小鼠ASMC在TNF-α的刺激下收縮增強，其部分機制可能為誘導(dǎo) ASMC中CD38信號通路活化。
　　第三部分 TNF-α-NF-κ

12、B-CD38/cADPR信號通路對肥胖型過敏性哮喘小鼠氣道反應(yīng)性的影響
　　目的:
　　探討TNF-α-NF-κB-CD38/cADPR軸是否參與肥胖型過敏性哮喘氣道高反應(yīng)性的形成。
　　方法:
　　40只雄性SPF級3周齡斷乳C57/B6J小鼠隨機分為4組，每組各10只。正常對照組進行普通飼料喂養(yǎng)+生理鹽水致敏激發(fā)，肥胖組予以高脂飼料喂養(yǎng)+生理鹽水致敏激發(fā)，哮喘組進行普通飼料喂養(yǎng)+OVA/Al(OH)3致敏激發(fā)

13、，肥胖型過敏性哮喘組則給予高脂飼料喂養(yǎng)+OVA/Al(OH)3致敏激發(fā)。使用小鼠肺功能儀測定各組小鼠的氣道反應(yīng)性，ELISA法檢測各組小鼠血清和BALF中TNF-α和cADPR的表達水平，免疫熒光染色觀察小鼠肺組織中NF-κ B核轉(zhuǎn)運激活情況，同時采用western blot法檢測肺組織中NF-κ B p65和Iκ Bα以及CD38蛋白的含量。
　　結(jié)果:
　　1.氣道反應(yīng)性:肥胖組、哮喘組和肥胖型過敏性哮喘組小鼠總氣道阻力

14、Rn（分別為0.5334±0.0112、0.6634±0.0062和0.7698±0.0238）與正常體重組(0.3229±0.0071)相比均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）;肥胖型過敏性哮喘組小鼠的Rn值最高，與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。應(yīng)用乙酰甲膽堿激發(fā)后，隨著濃度的不斷增加，各組小鼠的Rn值與其基線值相比也均逐漸增高。肥胖組和哮喘組小鼠Rn值上升趨勢較正常體重組相比均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意

15、義(P＜0.01);而肥胖型過敏性哮喘組小鼠Rn值的上升幅度最大，與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。
　　2.血清和BALF中TNF-α和cADPR的含量:肥胖組、哮喘組和肥胖型過敏性哮喘組血清和BALF中TNF-α的表達均顯著增高，與正常體重組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）;而三組之間的差異均無統(tǒng)計學意義。肥胖組、哮喘組和肥胖型過敏性哮喘組小鼠血清和BALF中cADPR的表達均顯著高于正常體重組，差

16、異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）;且肥胖型過敏性哮喘組的表達高于肥胖組和哮喘組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。
　　3.NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運免疫熒光強度:正常體重組小鼠NF-κ B核轉(zhuǎn)運熒光強度(ID)為183.265±0.876，顯著低于肥胖組(235.343±0.578)、哮喘組(235.417±0.504)和肥胖型過敏性哮喘組(234.584±0.771)，差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01);而肥胖組、哮喘組和

17、肥胖哮喘組之間差異均無統(tǒng)計學意義。
　　4.肺組織中NF-κ B p65、Iκ Bα蛋白的表達:正常體重組、肥胖組、哮喘組和肥胖型過敏性哮喘組小鼠肺組織中NF-κ B p65蛋白的表達分別為0.3342±0.003、0.3268±0.008、0.3312±0.009和0.3315±0.01，四組之間差異均無統(tǒng)計學意義。而正常體重組小鼠肺組織中Iκ Bα蛋白的表達(0.3818±0.003)顯著高于肥胖組(0.2411±0.006)