Cdc25B、Cyclin B1和Greatwall在小鼠卵母細胞雙線期阻滯中作用的研究.pdf

1、目的：
　　本研究以小鼠初級卵母細胞為研究對象，通過觀察Cdc25B-Ser351（對應在人類細胞中為Ser353）和Cyclin B1-Ser123（對應在人類細胞中為Ser126）位點的磷酸化對卵母細胞成熟的作用，p-Cdc25B-Ser351和p-Cyclin B1-Ser123的表達和定位，AURKA-Cdc25B通路以及Greatwall蛋白激酶對減數分裂恢復的作用來深入探討卵母細胞成熟的分子機制，為其發(fā)育機理提供相關實

2、驗依據。
　　材料與方法：
　　一、材料與試劑
　　昆明系SPF級雌性小鼠（3-5周齡）由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供;Waymouth's MB752/1培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基（Invitrogen）;M2培養(yǎng)基、M16培養(yǎng)基等。
　　二、卵母細胞以及受精卵的采集和培養(yǎng)
　　3-5周齡的昆明系雌鼠腹腔注射10 IU PMSG于46-48 h后頸椎脫臼法處死。剖開腹腔取出雙側卵巢置于含有dbcAMP的M2培養(yǎng)微滴

3、內，體視顯微鏡下用刀片盡量切碎卵巢組織，使卵母細胞游離到培養(yǎng)基中，篩選含有明顯且完整生發(fā)泡的裸卵母細胞并轉移到MB或M16培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　三、質粒定點突變
　　設計并合成質粒定點突變引物。
　　四、體外轉錄
　　模板制備，質粒pcDNA3.1-HA-Cyclin B1-WT, pcDNA3.1-HA-CyclinB1-Ser123A, pcDNA3.1-HA-Cycli

4、n B1-Ser123D, pcDNA3.1-Myc-Cdc25B-WT,pcDNA3.1-Myc-Cdc25B-Ser351A, pcDNA3.1-Myc-Cdc25 B-Ser351D pcDNA3.1-Myc-GWL-WT和pcDNA3.1-Myc-GWL-D173A分別各取1μg，經Agel酶切線性化。
　　五、mRNA顯微注射及呈像
　　顯微注射mRNA，應用Eppendorf Transferman顯微操作系統(tǒng)進

5、行mRNA顯微注射，應用Olympus IX-70倒置顯微鏡和DIC調制相差進行觀察。
　　六、Western印記
　　依據實驗需要收集特定時期的卵母細胞和受精卵，3000 rpm離心10 min后盡量去除上清培養(yǎng)液，收集的細胞可以直接保存在-80℃冰箱中也可以裂解后保存。經TBST洗滌后，HRP偶聯的抗兔lgG或抗羊IgG二抗(1∶4000)室溫孵育1h，洗膜，ECL化學發(fā)光法顯色，X-ray底片UVP凝膠成像分析系統(tǒng)掃描

6、呈像。
　　七、激光共聚焦掃描顯微鏡檢測熒光定位
　　依據實驗需要收集特定時期的卵母細胞，用含0.3％BSA的PBS洗液洗滌三次，4％多聚甲醛4℃固定過夜或室溫固定1h，洗液洗滌三次，0.5％TritonⅩ-100(溶于PBS中)打孔30 min。
　　八、MPF活性測定
　　依據實驗需要收集培養(yǎng)到指定時間點的卵母細胞各20個，用含0.3％BSA的PBS洗液洗滌三次后轉移到含有20μl的MPF活性測定緩沖液。

7、r>　　九、Stealth siRNA顯微注射
　　應用Eppendorf Transferman顯微操作系統(tǒng)進行siRNA顯微注射，應用OlympusⅨ-70倒置顯微鏡和DIC調制相差進行觀察。
　　十、實時定量熒光PCR
　　接受Stealth siRNA顯微注射的卵母細胞在含有dbcAMP的MB或M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后進行收集，對mRNA水平進行實時熒光定量PCR檢測。
　　結果：
　　一、 C

8、dc25B-Ser351和Cycl in B1-Ser123的磷酸化能夠促進小鼠卵母細胞恢復減數分裂，發(fā)生GVBD
　　注射Cdc25B-Ser351和Cyclin B1-Ser123的天冬氨酸突變型mRNA可以突破dbcAMP對卵母細胞的阻滯從而發(fā)生GVBD，而丙氨酸突變型mRNA則不具有促進GVBD的作用。
　　二、在小鼠卵母細胞GVBD的過程中，p-Cdc25B-Ser351先于p-Cycl in B1-Ser123募

9、集到中心體
　　免疫熒光結果顯示，GV期和beforeGVBD(early)期的卵母細胞中，檢測不到p-Cyclin B1-Ser123的熒光信號。直到before GVBD(late)期，p-Cyclin B1-Ser123才首次出現在中心粒周附近。卵母細胞發(fā)生GVBD后，p-Cyclin B1-Ser123彌散在整個卵母細胞空間。
　　三、AURKA磷酸化Cdc25B-Ser351并促進小鼠卵母細胞恢復減數分裂
　

10、　AURKA可以在中心體位置磷酸化Cdc25B-Ser351并通過維持正確的紡錘體組裝從而調控卵母細胞減數分裂。
　　四、 GWL蛋白激酶在小鼠卵母細胞和早期合子中的表達和定位
　　為了檢測GWL在小鼠卵母細胞中的表達和定位，收集培養(yǎng)到特定時期的卵母細胞進行免疫印跡和免疫熒光檢測。結果顯示在GV, MⅠ，MⅡ期卵母細胞和1，2-cell期受精卵中，GWL主要定位在細胞核。在1，2-cell期受精卵中，除了核定位GWL還有一部

11、分分布在受精卵的皮質區(qū)。免疫印跡結果顯示GWL從GV, MⅡ卵母細胞到2-cell期受精卵穩(wěn)定表達。GWL作為一種核定位蛋白被發(fā)現，也有研究表明GWL與中心體具有共定位。因此我們檢測了GWL與中心粒周蛋白的免疫熒光定位，結果顯示兩者不存在共定位分布。
　　五、過表達GWL蛋白激酶能夠促進小鼠卵母細胞恢復減數分裂
　　為了檢測GWL在第一次減數分裂前期阻滯的卵母細胞中的作用，向置于含dbcAMP的M2培養(yǎng)基中的卵母細胞顯微注射

12、編碼GWL-WT或GWL-D173A的mRNA。注射后轉移到含有dbcAMP的M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)。20 h后，GWL-WTmRNA注射組的GVBD率為89％(16％ at1h，73％ at2h and88％ at3h)，MⅡ率為72％; GWL-D173A mRNA注射組的GVBD率僅為7％(4％ at1h，6％at2h，and7％at3h)，MⅡ率為5％; TE buffer注射組沒有卵母細胞發(fā)生GVBD。然而在GWL-WTmRNA注

13、射組，盡管MⅡ率高達72％，但是我們發(fā)現有55％在形態(tài)上到達MⅡ期的卵母細胞中具有明顯的染色體分離缺陷，異常分離的染色體分布在卵母細胞整個空間范圍內并且以皮質部居多，對照組中的卵母細胞則具有正常的第一極體排出。
　　六、敲低GWL蛋白激酶引起部分卵母細胞發(fā)生GV阻滯
　　為了進一步探討GWL對于小鼠卵母細胞減數分裂的調控，我們利用GWL特異性siRNA來敲低卵母細胞內GWL的表達水平。向置于含dbcAMP的M2培養(yǎng)基中的卵母

14、細胞顯微注射Gwl-siRNA。將注射后的卵母細胞轉移到含dbcAMP的M16培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，隨后轉移到不含dbcAMP的M16培養(yǎng)基中釋放。釋放培養(yǎng)4h后，86％的卵母細胞依然阻滯在GV期，然而在未注射組以及對照siRNA注射組中大部分的卵母細胞發(fā)生GVBD并且發(fā)育到MⅡ期。
　　七、抑制PP2A活性可以逆轉由于敲低GWL蛋白激酶引起的GV阻滯
　　由于在爪蟾胚胎早期發(fā)育過程中，GWL能夠間接抑制PP2A的活性，因此我

15、們猜測敲低GWL所引起的GV期阻滯可能是通過解除GWL對PP2A活性的抑制來調控的，于是此我們設想抑制PP2A的生物學功能可能會逆轉由于敲低GWL所引起的GV期阻滯。為了驗證這種猜想，我們分別使用岡田酸和Ppp2r2d-siRNA來抑制卵母細胞中PP2A的活性。卵母細胞注射Gwl-siRNA后在含dbcAMP的M16中培養(yǎng)24 h，隨后釋放到含有或者不含岡田酸的M16中培養(yǎng)。釋放培養(yǎng)20 h后，經OA處理的卵母細胞有74％(19％ at

16、1h，63％ at2h，and72％ at3h)發(fā)生GVBD，然而在未經OA處理的卵母細胞中只有10％(3％ at1h，10％ at2h，and10％ at3h)發(fā)生GVBD。另外，PPP2R2D敲低的卵母細胞組在釋放培養(yǎng)20h后有50％(16％ at1h，48％ at2h，and50％ at3h)發(fā)生GVBD，GWL和PPP2R2D共同敲低的卵母細胞有44％(12％ at1h，39％ at2h，and43％ at3h)發(fā)生GVBD。在

17、Gwl對照siRNA注射組中有92％(8％ at1h，89％ at2h，and92％ at3h)的卵母細胞發(fā)生GVBD，在OA處理的Gwl對照siRNA注射組中有93％(19％ at1h，93％ at2h，and93％ at3h)的卵母細胞發(fā)生GVBD。
　　結論：
　　1、AURKA磷酸化Cdc25B-Ser351，Ser351磷酸化的Cdc25B先于p-CyclinB1-Ser123募集到微管組織中心，兩者向微管組織中心