人胎兒來源干細胞的心肌分化潛能研究.pdf

1、歐洲和美國現(xiàn)有1900萬兒童和成年人的心衰患者，導致每年23萬人的死亡和1400億美元的醫(yī)療費用。全世界范圍內(nèi)每年有250萬先心病兒童出生，這其中許多患兒最終進展為心衰。盡管目前臨床采用的藥物治療、介入治療及心臟外科手術(shù)治療等方法能夠在一定程度上緩解病情，但是對于有功能心肌細胞數(shù)量減少和收縮功能下降導致的心衰仍然沒有根治的方法。以干細胞移植為基礎(chǔ)的細胞治療和組織工程治療有望修復損傷心肌或增強心功能，因此有望成為心衰治療的新方法，已成為再

2、生醫(yī)學基礎(chǔ)研究中的熱點。胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細胞以及羊膜上皮細胞來自分娩后的廢棄物，組織來源豐富，在基礎(chǔ)研究及臨床應用上無倫理學限制;并且，它們介于成體干細胞和胚胎干細胞之間，具有很低的免疫原性、很高的增殖能力以及分化能力。另外，隨著干細胞庫的發(fā)展，越來越多的人選擇保存胎兒來源的干細胞，使得胎兒來源干細胞具有在未來實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。因此可知，臍帶間充質(zhì)干細胞及羊膜上皮細胞等胎兒來源的干細胞具有應用于心臟疾病臨床治療的巨大潛力，是短期內(nèi)

3、有望取得臨床治療突破的種子干細胞。
　　 心臟組織再生醫(yī)學需要大量的、高功能的種子干細胞，目前獲得大量干細胞的最常規(guī)方法是體外連續(xù)傳代。研究表明，臍帶間充質(zhì)干細胞可以在體外連續(xù)傳代，但這種連續(xù)傳代過程改變了其成骨和成脂定向分化能力，對于心肌分化能力是否有影響目前尚不清楚。此外，體外連續(xù)傳代是否影響羊膜上皮細胞增殖特性、干性維持及向心肌分化能力還未有報道。并且，同一胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞的上述生物學特性是否有差異

4、也鮮見研究。因此，闡明上述問題對于確定種子干細胞來源、定制干細胞體外擴增方案及預測體內(nèi)心肌修復效果等具有十分重要的意義。
　　 目的:
　　 本研究對不同胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細胞以及羊膜上皮細胞進行體外連續(xù)傳代，分析傳代過程對這兩種干細胞增殖特性、干性維持以及心肌分化能力的作用規(guī)律;對同一胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞的上述生物學特性進行比較分析，研究兩者之間的差異與聯(lián)系;初步探索個體間差異對這兩種干細胞生物

5、學特性的影響。
　　 方法：
　　 20例臍帶與羊膜均來自大連市婦產(chǎn)醫(yī)院正常足月分娩新生兒。利用組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，利用酶消化法獲得羊膜上皮細胞，并利用流式細胞儀進行相關(guān)干細胞表面標志的鑒定。對這兩種干細胞進行常規(guī)體外連續(xù)傳代，利用CCK-8、流式細胞儀及real-time PCR等手段檢測不同代數(shù)干細胞增殖特性、表面標志、細胞周期、干性基因標志物的表達情況;添加5-氮雜胞苷以及抗壞血酸磷酸鈉分別對不

6、同代數(shù)的臍帶間充質(zhì)干細胞以及羊膜上皮細胞進行心肌分化誘導，利用real-time PCR分析心肌細胞標志基因Nkx2.5以及GATA4的基因表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用組織塊培養(yǎng)法獲得了臍帶間充質(zhì)干細胞，細胞呈現(xiàn)長梭形，表達間充質(zhì)干細胞典型表面標志物，CD73、CD90及CD105表達均在95％以上;利用優(yōu)化的二次酶消化法獲得了羊膜上皮細胞，細胞呈扁平狀多角形，細胞之間排列緊密，具有典型的上皮細胞形態(tài)，原代羊

7、膜上皮細胞表達干性標志物SSEA-4(25％-96％)。
　　 2、隨著傳代次數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖速率逐漸降低，所具有的人胚胎干細胞干性基因Oct3/4及Nanog的表達水平逐漸降低，且其表達存在較大個體差異，所具有的中胚層標志基因Vimentin在第7代表達最高，細胞表面標志物（CD73、CD90及CD105）表達穩(wěn)定;經(jīng)過5-氮雜胞苷體外誘導后，心肌標志基因Nkx2.5隨著傳代次數(shù)增加表達水平增高，但是個體差

8、異較大。
　　 3、隨著傳代次數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細胞的增殖速率降低，細胞形態(tài)不均勻，某些樣本出現(xiàn)纖維細胞形態(tài)的細胞，羊膜上皮細胞的干性標志物SSEA-4表達逐漸下降，說明羊膜上皮細胞在目前條件下還不能在體外連續(xù)傳代，其表型難以維持;2-3代上皮細胞經(jīng)過抗壞血酸磷酸鈉體外誘導后，不同樣本的心肌標志基因Nkx2.5以及GATA4表達水平差異很大，有些樣本心肌標志基因甚至沒有表達，這提示羊膜上皮細胞的心肌分化能力存在更大的個體差異

9、，此差異與SSEA-4表達水平不相關(guān)。
　　 4、通過將同一胎兒來源的臍帶間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)某些樣本來源的第三代羊膜上皮細胞經(jīng)過誘導，其Nkx2.5表達水平相當于第7代臍帶間充質(zhì)干細胞的表達水平，GATA4表達則相當于第14代臍帶間充質(zhì)干細胞的表達水平，這說明盡管羊膜上皮細胞目前體外培養(yǎng)條件還存在問題，盡管某些樣本來源的羊膜上皮細胞不具有心肌分化能力，但是研究結(jié)果提示有些樣本來源的羊膜上皮細胞心肌分化潛能可