人臍血間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)為類許旺細胞的基因表達學(xué)特性研究.pdf

1、背景：周圍神經(jīng)缺損在創(chuàng)傷骨科中較為常見，目前對于大段神經(jīng)缺損主要采用自體神經(jīng)移植修復(fù)，但因其局限性無法在臨床中廣泛開展。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，利用人工神經(jīng)修復(fù)大段神經(jīng)缺損有望成為最佳治療方案。種子細胞即許旺細胞是人工神經(jīng)研究的核心，由間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)所得的類許旺細胞相對自體、異體許旺細胞而言具有優(yōu)越性，因而成為獲取許旺細胞的相對較好方式。間充質(zhì)干細胞來源廣泛，如骨髓、臍帶、臍血、脂肪等，臍血間充質(zhì)干細胞具有自身優(yōu)越性更加吸引研究者。將間

2、充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)為類許旺細胞的過程是通過調(diào)節(jié)基因表達以實現(xiàn)誘導(dǎo)目的，通過研究誘導(dǎo)過程中的基因表達學(xué)特性，如果能在基因表達學(xué)轉(zhuǎn)錄層面上證明類許旺細胞更接近許旺細胞或了解它們之間的差異，為后期的進一步深入研究提供一定理論依據(jù)。
　　目的：培養(yǎng)人臍血間充質(zhì)干細胞（HUCBMSCs）、由HUCBMSCs誘導(dǎo)而來的類許旺細胞（類SCs）和許旺細胞（SCs），提取三種細胞mRNA，運用基因芯片技術(shù)分析三種細胞的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，篩選目的

3、基因，說明誘導(dǎo)后的類SCs比較接近SCs。
　　方法：沿用本課題組以往采用的紅細胞沉降、密度梯度離心法提取、純化人臍血中的HUCBMSCs，低酶消化、差速貼壁、條件培養(yǎng)基法提取、純化引產(chǎn)胎兒坐骨神經(jīng)SCs，并通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細胞儀法對其鑒定及純度測定，達到實驗標(biāo)準(zhǔn)后進行下一步實驗。沿用本課題組前期優(yōu)化的誘導(dǎo)方案將第三代HUCBMSCs誘導(dǎo)為類SCs。三種細胞準(zhǔn)備完畢后提取各自mRNA，利用基因芯片技術(shù)對其表達基因進行分析，

4、先篩選出HUCBMSCs、類SCs之間的差異表達基因，再將這些差異表達基因與SCs表達基因進行匹配篩選出二者表達無差異性基因，最后在二次篩選且為上調(diào)的基因中找出對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)有意義的基因。選取部分基因進行RT-PCR驗證。
　　結(jié)果：1）由HUCBMSCs誘導(dǎo)而來的SCs與誘導(dǎo)前的HUCBMSCs相比存在差異表達基因（含誘導(dǎo)后新表達的基因）數(shù)為6331個，其中上調(diào)基因數(shù)為3569個，下調(diào)基因數(shù)為2762個，這些差異表達基因除細

5、胞自身分化等因素外可能是誘導(dǎo)引起。2）將上述差異表達基因進行GO富集分析，在細胞組分、分子功能、生物過程三大分類中分別占10.4％、21.2％、68.4％，出現(xiàn)顯著富集的條目主要集中在G蛋白偶聯(lián)受體活性等27個條目中。3）將上述差異表達基因與SCs表達基因相匹配，存在無差異表達基因數(shù)為2265個，說明經(jīng)誘導(dǎo)而來的類SCs在基因表達學(xué)轉(zhuǎn)錄水平方面更接近SCs。4）將上述匹配的基因結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻報道綜合分析，在匹配的上調(diào)基因中找出了6個對

6、神經(jīng)損傷修復(fù)有一定意義的基因，即S100鈣結(jié)合蛋白β、人膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、紐蛋白、早期生長反應(yīng)因子2、中文名為蛋白激酶Cα、中文名為蛋白激酶Cη。5）在篩選的6個基因中選取2個進行RT-PCR驗證，驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗進一步驗證了本課題組對HUCBMSCs及SCs提取方法的可行性。
　　2.從本實驗檢測結(jié)果角度看HUCBMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后在基因表達學(xué)的轉(zhuǎn)錄水平方面更接近SCs。