中外豬種胚胎不同發(fā)育時(shí)期骨骼肌轉(zhuǎn)錄組和全基因組甲基化分析.pdf

1、豬是肉類蛋白的主要來(lái)源，同時(shí)，也可作為研究人類健康問(wèn)題的重要醫(yī)學(xué)模型。骨骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最豐富的組織，因此研究豬骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)肉質(zhì)生產(chǎn)科學(xué)和人類醫(yī)學(xué)都具有重大意義。本研究以生長(zhǎng)速度和肉質(zhì)性狀存在顯著差異的約克夏豬和通城豬作為研究對(duì)象，采用RNA-seq技術(shù)，探索了妊娠期40，55，63，70和90天兩豬種胚胎背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因不同的時(shí)序性表達(dá)規(guī)律，推測(cè)了兩豬種間肌纖維發(fā)育差異的時(shí)間拐點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上探究中外豬種在妊娠時(shí)期胚胎骨骼肌發(fā)育

2、的分子調(diào)控機(jī)理;使用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(WGBS)技術(shù)，檢測(cè)了妊娠期55天兩豬種胚胎背最長(zhǎng)肌的差異甲基化圖譜，分析了兩豬種差異DNA甲基化對(duì)肌纖維發(fā)育的調(diào)控;并對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了聯(lián)合分析，分析了DNA甲基化對(duì)兩豬種肌纖維發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)基因的調(diào)控作用，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下;
　　1.利用RNA-seq技術(shù)獲得了通城豬和約克夏豬妊娠5個(gè)時(shí)期的胚胎背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，并利用熒光定量PCR驗(yàn)證

3、了測(cè)序結(jié)果的可靠性。在通城豬和約克夏豬分別篩選到1317個(gè)和691個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分別對(duì)上述通城豬和約克夏豬的發(fā)育依賴的DEGs進(jìn)行時(shí)序性分析，發(fā)現(xiàn)了在兩個(gè)豬種中都顯著富集到的表達(dá)模式0，39，20和21，表達(dá)模式10，11，13和25只在通城豬中顯著富集，表達(dá)模式14和15只在約克夏豬中顯著富集。分別對(duì)通城豬和約克夏豬的差異基因進(jìn)行GO和KE

4、GG通路功能注釋及富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩豬種共同表達(dá)模式39顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的GO條目;共同表達(dá)模式0顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的GO條目。通路富集分析結(jié)果顯示，通城豬和約克夏豬差異表達(dá)基因富集的前10條通路中有8條是兩豬種共同富集到的，但富集程度不同。這些結(jié)果說(shuō)明妊娠時(shí)期胚胎的背最長(zhǎng)肌的發(fā)育機(jī)制在兩豬種中有相似之處，又存在一定的差異。
　　2.對(duì)兩個(gè)豬種分別在5個(gè)時(shí)期的基因表達(dá)

5、進(jìn)行差異比較分析，總共獲得了1677個(gè)差異表達(dá)基因。5個(gè)比較組中，妊娠55天的差異表達(dá)基因最多。對(duì)兩個(gè)豬種間的差異基因進(jìn)行GO和KEGG通路功能注釋及富集分析，發(fā)現(xiàn)黏著斑(Focal adhesion)，細(xì)胞外基質(zhì)受體互作(ECM-receptor interaction)，氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8條顯著富集的通路。然后，對(duì)兩豬種間差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)PTEN,EP300，M

6、YO9A，CDK14，IRS1，PPP1CC和一些核糖體蛋白基因可能對(duì)揭示兩豬種胚胎肌肉發(fā)育差異有重要作用。
　　3.通過(guò)ASprofile軟件分析，發(fā)現(xiàn)第一個(gè)外顯子可變剪切(TSS)和最后一個(gè)外顯子可變剪切(TTS)事件是兩豬種中最主要的可變剪切類型。
　　4.本研究通過(guò)WGBS技術(shù)構(gòu)建了通城豬和約克夏豬在妊娠55天時(shí)胚胎背最長(zhǎng)肌全基因組DNA甲基化圖譜，并揭示了其DNA甲基化特征;CG雙核苷酸甲基化是兩豬種基因組DNA甲

7、基化的主要方式，只有極少部分DNA甲基化發(fā)生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中，CG位點(diǎn)甲基化水平在內(nèi)含子和3，UTR中的DNA甲基化水平較高，而非CG位點(diǎn)甲基化水平在CGI區(qū)域最高。
　　5.通過(guò)WGBS技術(shù)，通城豬和約克夏豬之間獲得了211822個(gè)差異甲基化區(qū)域(DMR)，涉及到了12261個(gè)差異甲基化基因(DMG)，其中在通城豬中差異高甲基化的有36582個(gè)DMR，涉及到DMG個(gè)數(shù)為5301;在約克夏豬中

8、差異高甲基化的DMR為175240個(gè)，涉及到DMG為11746個(gè)。對(duì)兩豬種的DMGs進(jìn)行GO和KEGG通路功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)在CG、CHG、GHH三種不同序列環(huán)境下的DMGs都顯著富集到多個(gè)GO條目;KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)非CG序列環(huán)境下的DMGs均顯著富集到多條通路，而CG序列環(huán)境下的DMGs只顯著富集到磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(Phosphatidyhnositol signaling system)。通過(guò)WGBS技術(shù)，鑒定到啟動(dòng)

9、子區(qū)域的DMR為5946個(gè)，涉及到DMG為4578個(gè)。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DMGs進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)只有CHH序列背景下的DMGs顯著富集到了GO條目，但是在三種序列背景下的DMGs主要富集到的GO條目中有一些與肌肉發(fā)育相關(guān)GO條目;在三種序列背景下的DMGs都沒(méi)有顯著富集到通路，但主要富集的通路中都有核糖體(Ribosome)，這表明核糖體通路中基因啟動(dòng)子甲基化可能會(huì)調(diào)控肌肉的發(fā)育。
　　6.對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與全基因組甲

10、基化測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，通過(guò)在整體水平上分析DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩豬種在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2kb及基因本體靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);基因本體靠近轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。檢測(cè)到同時(shí)是DMG又是DEG的基因個(gè)數(shù)616個(gè)，對(duì)其進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，主要富集的通路中黏著斑，Wnt信號(hào)通路(Wnt signahng pathway)，凋亡(Apopt

11、osis-multiple species)，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和TGF-beta信號(hào)通路（TGF-beta signahng pathway）在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。
　　7.構(gòu)建候選基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并篩選到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)干涉RPL6和TPPP3基因表達(dá)后，肌管形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)兩

12、個(gè)干涉組的肌管數(shù)目都明顯低于對(duì)照組，且RPL6干涉組的肌管明顯變粗。使用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)干涉RPL6和TPPP3基因表達(dá)后，對(duì)C2C12細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，發(fā)現(xiàn)RPL6基因參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，干涉RPL6后會(huì)使滯留于G1期的細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，滯留于S期和G2期的細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組;發(fā)現(xiàn)干涉TPPP3后，細(xì)胞周期各階段的細(xì)胞比例與對(duì)照組相比皆無(wú)明顯差異。通過(guò)免疫熒光技術(shù)鑒定到超表達(dá)基因RPL6可以增加細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(PC