基于酶催化信號擴增電化學檢測DNA甲基化及其應用研究.pdf

1、DNA甲基化是基因組中的一種重要的表觀遺傳修飾，在原核生物和真核生物生長發(fā)育中扮演重要的角色。異常的DNA甲基化與各種疾病有關(guān)，例如癌癥。眾所周知，DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到5'-CG-3'序列（CpG）的胞嘧啶5位碳上，生成5-甲基胞嘧啶，或者將甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的6位碳上。因此DNA甲基化水平與甲基轉(zhuǎn)移酶活性息息相關(guān)，檢

2、測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制因子篩選有重要意義。目前，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測方法主要有放射性標記、重硫酸鹽處理、比色和高效液相法等。但這些方法存在一些缺點，如放射性標記法對生物組織有傷害，重硫酸鹽處理將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶耗時長，比色法雖然簡單，但金納米粒子容易聚沉，高效液相色譜法需要大型儀器成本高。因此，發(fā)展簡單、快速DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析方法非常必要。5-hmC被認為是基因中的第六種堿基，主要分布于神經(jīng)元細胞，小鼠腦細胞和

3、胚胎干細胞中。同時，在許多種癌細胞中它的含量相對于正常細胞降低。因此，5-hmC的表達水平可以作為檢測癌癥的標志物。目前檢測5-hmC的方法有薄層色譜法、高效液相法、酶催化放射性標記法等，但是這些方法都有許多缺點。例如，高效液相法需要大型儀器，酶催化放射性標記法傷害生物組織。因此，依然需要發(fā)展一種簡單、快速檢測基因組DNA中5-hmC的方法。本文利用CdS量子點、Bi2S3光電納米材料、生物酶和抗體等，并通過酶催化放大技術(shù)，制備了兩種光

4、電化學生物傳感器和兩種電化學生物傳感器，對甲基轉(zhuǎn)移酶活性進行了分析并且對細胞中5-hmC的含量進行了檢測。
　　(1)本文利用Bi2S3光電納米材料和酶催化信號放大技術(shù)制備了一種用于 M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析和其抑制因子篩選的光電生物傳感器。5-mC抗體作為識別單元，SA-AuNPs作為信號擴增單元，ALP作為酶催化單元。在甲基轉(zhuǎn)移酶存在的情況下，發(fā)卡 DNA可以被甲基化。當與生物素修飾的DNA雜交后形成雙鏈 DNA（ds-

5、DNA），ds-DNA可以被俘獲到抗體修飾的電極表面，隨后SA-AuNPs和ALP-biotin可以通過生物素與鏈霉親和素的特異性識別依次被俘獲到電極表面。堿性磷酸酯酶（ALP）原位催化水解L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽產(chǎn)生抗壞血酸分子作為電子供體，從而增強光電信號。制備的傳感器表現(xiàn)出了很好的靈敏性，對甲基轉(zhuǎn)移酶檢測限為0.33 unit/mL。而且，對抑制劑的篩選證明RG108對甲基轉(zhuǎn)移酶活性有抑制作用，半數(shù)抑制量為152.54 nM。

6、
　　(2)基于G-四連體和ExoIII的電化學傳感器檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性。首先，探針雙鏈DNA固定到金電極表面，隨后將 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶滴加到電極表面，甲基化后用DpnI切割。這樣甲基化的DNA鏈可以被ExoIII消解釋放富含G的DNA單鏈。在氯化血紅素和鉀離子存在的情況下，其可以形成氯化血紅素/G-四連體結(jié)構(gòu)。氯化血紅素/G-四連體可以在雙氧水存在的情況下催化對苯二酚生成苯醌。苯醌可以產(chǎn)生較大的電信號。最后我們用還原石墨烯修飾的

7、金電極作為工作電極進行電化學測量。制備的電化學傳感器展現(xiàn)了較好的靈敏度。對DAM甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測限為0.31 unit·mL-1。抑制劑的研究表明，表兒茶素能夠抑制DAM甲基轉(zhuǎn)移酶活性，半數(shù)抑制量為157μM。
　　(3)基于5-hmC抗體，生物素功能化的phos-tag(Phos-tag-biotin)和親和素修飾的堿性磷酸酯酶(avidin-ALP)的電化學免疫傳感器定量檢測乳腺癌細胞中的5-hmC。5-hmC抗體作為識別單元

8、，Phos-tag-biotin作為連接單元，avidin-ALP作為酶催化信號擴增單元。首先5-羥甲基胞嘧啶脫氧核苷酸被俘獲到抗體修飾的電極表面，之后Phos-tag-biotin通過與磷酸根的作用俘獲到電極表面。最后，avidin-ALP通過親和素和生物素的特異性結(jié)合作用固定到電極表面。通過 ALP催化對硝基苯磷酸二鈉產(chǎn)生電活性分子對硝基苯酚。實驗結(jié)果表明，制備的電化學免疫傳感器展現(xiàn)出了很好的靈敏度，檢測限為0.032 nM。而且通

9、過制備的電化學免疫傳感器成功的對乳腺癌細胞中的5-hmC含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)與正常乳腺細胞比較，5-hmC在乳腺癌細胞中的含量大量降低。
　　(4)基于原位產(chǎn)生電子供體和全波長光作為激發(fā)光的策略制備光電傳感器檢測5-hmC。首先，通過酰胺鍵將氨基修飾的探針 DNA固定到羧基修飾的磁性微球表面。在 M.HhaI和半胱胺存在的條件下，含有5-hmC的探針 DNA可以被氨基化。隨后NHS-biotin能夠被標記到氨基化的DNA鏈上。隨后