PTEN在肝癌惡性進展過程中促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用研究.pdf

1、目的:
　　原發(fā)性肝癌主要存在兩種組織類型:肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)和肝內(nèi)膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC），其中肝細胞肝癌最常見，約占70％到85％。肝炎病毒、酒精性肝病、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖等被證明是肝癌發(fā)病的重要危險因素。肝臟腫瘤的臨床發(fā)生一般經(jīng)歷慢性肝炎，長期的慢性刺激或大范圍急性病變發(fā)展成肝硬化，最終肝癌產(chǎn)生。當前肝移植及手

2、術(shù)切除等治療方案均未明顯改善患者預后，而且肝癌肝內(nèi)和門脈轉(zhuǎn)移對患者預后有重要影響。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種因素多階段共同作用的結(jié)果，探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機制，對于控制和治療肝癌有十分重要的意義。
　　PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10)是第十號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白類似物。在一些高度惡性腫瘤中常有PTEN缺失，如Cowden綜合征(Cowden's

3、 syndrome)，又稱多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征，它是PTEN胚系突變引起的常染色體遺傳疾病。PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性，主要通過拮抗PI3K/AKT信號通路，調(diào)控多種生命過程，如細胞周期、細胞衰老、細胞黏附、極性、細胞骨架、染色體的完整性等。同時也有大量文獻報道PTEN在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中起到了非常重要的作用。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指由于各種因素

4、的誘導，上皮細胞自身骨架結(jié)構(gòu)改變，同時細胞間、細胞與基底膜間、細胞與細胞外基質(zhì)之間聯(lián)系也發(fā)生變化，獲得間質(zhì)細胞形態(tài)和特性的過程。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤惡性進展的過程中有十分重要的意義，有文獻報道鼻咽癌細胞中，來源于EB病毒的miRNA EBV-miR-BART7-3p靶向抑癌基因PTEN，活化的PI3K/AKT/GSK-3β信號通路使核內(nèi)Snail和β-catenin集聚促進EMT。
　　本課題組先前在探索PTEN肝癌中作用的過程中，

5、發(fā)現(xiàn)肝癌中PTEN的表達并不因為其作為抑癌基因而減少，由此我們意圖通過探討PTEN在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮作用的方式，以及其與EMT的關(guān)系，從而進一步為肝癌患者判斷預后、評價轉(zhuǎn)移風險及尋找肝癌治療新靶點提供相關(guān)的實驗和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、通過蛋白免疫印跡法和實時定量PCR檢測肝癌患者癌、癌旁、正常組織樣品中PTEN的表達情況;并用免疫組織化學的方法，分析肝癌組織芯片中PTEN的表達。
　　2、通過測序分析

6、肝癌患者癌、正常組織以及肝癌細胞系中PTEN的突變情況;檢索腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫信息，對PTEN在肝癌中的突變情況進行橫向和縱向比較。
　　3、通過蛋白免疫印跡法檢測肝癌細胞系中PTEN的表達水平以及EMT相關(guān)蛋白的表達水平;通過CCK8增殖、遷移及侵襲實驗比較不同亞群肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力;在低糖培養(yǎng)基下，觀察不同亞群細胞的耐受能力。
　　4、建立干擾P

7、TEN穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并用蛋白免疫印跡、RT-PCR檢測干擾效果及其對于細胞EMT狀態(tài)的影響;評估細胞增殖、遷移、侵襲能力的變化。
　　5、通過蛋白免疫印跡法觀察肝癌細胞系中過表達PTEN后，細胞EMT相關(guān)蛋白標志的變化;比較過表達PTEN對于細胞增殖、遷移、侵襲能力影響。
　　6、使用TGF-β誘導肝癌細胞系發(fā)生EMT，利用蛋白免疫印跡法及實時定量PCR觀察誘導效果。
　　7、使用TGF-β誘導干擾PTEN肝癌細胞系發(fā)生

8、EMT，利用蛋白免疫印跡法及實時定量PCR觀察誘導效果。
　　8、使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，研究PTEN對于E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　9、肝特異性敲除PTEN小鼠，使用DEN聯(lián)合CCl4的方案進行誘癌，體內(nèi)試驗研究PTEN對于在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
　　10、肝特異性敲除PTEN小鼠與K-ras激活突變小鼠雜交，觀察小鼠生長。
　　結(jié)果:
　　1、盡管PTEN作為抑癌基因，但是其在肝癌組織

9、中的表達水平相較于癌旁和正常組織并不低。轉(zhuǎn)錄水平也證明癌中PTEN的表達要高于相應的癌旁和正常組織。組織芯片結(jié)果顯示肝癌組織中PTEN表達并不低。
　　2、27對臨床肝癌組織樣本以及肝癌細胞中未檢測到PTEN的突變。檢索TCGA數(shù)據(jù)庫， Liver Hepatocellular Carcinoma(AMC， Hepatology2014)和LiverHepatocellular Carcinoma(TCGA，Provisional

10、)中，PTEN突變分別為2％和7％。與其他種類的腫瘤縱向比較，突變水平很低。
　　3、根據(jù)肝癌細胞系中EMT相關(guān)標志蛋白的表達差異，分成以LO2、QSG-7701、SMMC-7721、HCC-LM3、PLC/REF/5、SK-Hep-1為代表的M群，它們高表達Vimentin;而E群細胞有HepG2、Huh7、MHCC97H、MHCC97L、PVTT，它們高表達E-cadherin。M群細胞中PTEN的表達水平要明顯高于E群細胞。

11、M群的細胞增殖、遷移、侵襲能力總體上要比E群的細胞強，其生長更加依賴于葡萄糖。
　　4、干擾PTEN，細胞內(nèi)間質(zhì)性相關(guān)指標如N-cadherin、Vimentin在蛋白和RNA水平均下調(diào)。同時，細胞的遷移和侵襲能力在干擾PTEN后要明顯下降。
　　5、上皮型Huh7細胞隨著PTEN腺病毒量的增加，轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達量升高，引起E-cadherin的下調(diào)，間質(zhì)性標志Vimentin表達上升。在間質(zhì)型細胞SMMC-7721

12、，過表達PTEN，引起轉(zhuǎn)錄因子Snail上調(diào)的同時也促進了間質(zhì)性指標N-cadherin、Vimentin的表達。而且這種作用隨著PTEN過表達程度的增加，呈現(xiàn)出下降趨勢，但仍維持在較高水平。SMMC-7721和Huh7細胞中過表達PTEN后:細胞的增殖能力呈現(xiàn)下降趨勢;遷移能力在一定水平增加，超過一定程度出現(xiàn)減弱。
　　6、TGFβ處理后，肝癌細胞PTEN的表達在蛋白水平上調(diào)。實時定量PCR也證明在轉(zhuǎn)錄水平，TGFβ的作用使細胞

13、出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，PTEN的表達上調(diào)。
　　7、干擾PTEN背景下，TGFβ誘導細胞發(fā)生EMT的效應減弱。
　　8、PTEN影響CDH1轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性;TGFβ促進PTEN啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。
　　9、PTEN在腫瘤發(fā)生的早期具有抑癌作用。
　　10、KPC小鼠自發(fā)生成膽管癌。
　　結(jié)論:
　　在肝癌發(fā)生的早期，PTEN具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。而在肝癌發(fā)生后，PTEN高表達促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，低表