深部腦經(jīng)顱刺激對銅腙誘導(dǎo)的C57BL-6小鼠髓鞘損傷的影響及其炎性機(jī)制探討.pdf

1、背景和目的：
　　重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（rTMS)是一種無痛、無創(chuàng)、在大腦外部對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行刺激的電生理技術(shù)，深部腦經(jīng)顱刺激(DMS)是經(jīng)顱磁刺激的一種。精神分裂癥的病因復(fù)雜，病理機(jī)制仍不十分明確。近年來，越來越多的證據(jù)表明感染和免疫功能異常可能與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，小膠質(zhì)細(xì)胞異常活化引起的神經(jīng)炎癥與腦白質(zhì)損傷有密切的關(guān)系。同時，隨著rTMS的廣泛使用，越來越多的臨床證據(jù)表明rTMS治療能夠改善精神分裂癥患者的幻聽及陰性癥狀。因

2、此我們推測，精神分裂癥腦內(nèi)神經(jīng)炎癥及腦白質(zhì)損傷是其發(fā)病機(jī)制之一， rTMS/DMS通過影響腦內(nèi)炎性過程參與白質(zhì)保護(hù)。為驗(yàn)證該假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)擬以銅腙（Cuprizone，CPZ）暴露小鼠作為精神分裂癥腦白質(zhì)損傷動物模型，研究DMS對小鼠行為、白質(zhì)損傷以及神經(jīng)炎癥的作用，探討rTMS/DMS治療精神分裂癥的作用機(jī)制。
　　材料和方法：
　　實(shí)驗(yàn)動物為雄性C57BL/6小鼠,5周齡56只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)小鼠在動物

3、房飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為4組，每組14只，分別為：1)Control組:不給予任何刺激，置于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)；2)CPZ組:給予0.2％ CPZ飲食，連續(xù)5周；3)CPZ+Sham組:0.2%CPZ飲食，連續(xù)5周，并且在第2周開始給予假刺激（只有聲音沒有磁場）4周；4)CPZ+DMS組:0.2% CPZ飲食，連續(xù)5周，并且在第2周開始給予DMS治療4周。在CPZ飼養(yǎng)及物理干預(yù)結(jié)束之后，執(zhí)行曠場實(shí)驗(yàn)、社會互動實(shí)驗(yàn)和Y-迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的

4、行為學(xué)改變。之后每組7只在麻醉下灌注取腦。用免疫組化的方法檢測小鼠腦內(nèi)MBP蛋白表達(dá)來的改變，以及少突膠質(zhì)細(xì)胞（GST-Pi陽性細(xì)胞）和小膠質(zhì)細(xì)胞（Ibal-1陽性細(xì)胞）數(shù)量的改變。余下的每組7只小鼠在麻醉下取新鮮腦組織，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），檢測腦內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel2010和SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（-X±SE）表示，采用單

5、因素方差分析（One-way ANOVA）的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊，再采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊采用Dunnett`s T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05、P＜0.01分別表示為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. CPZ對小鼠行為學(xué)的影響及DMS的干預(yù)作用
　　(1)曠場實(shí)驗(yàn)：四組總的路程（P＞0.05）、中央路程（P＞0.05）及中央活動時間（P＞0.05）

6、無顯著差異。與正常組相比CPZ組與CPZ+Sham組小鼠中央路程/總路程均降低（P＜0.05），而CPZ+DMS組與正常組相比無明顯差異（P＞0.05），與CPZ+Sham組相比中央路程/總路程顯著增加（P＜0.01）。提示DMS治療能改善CPZ誘導(dǎo)的小鼠的焦慮行為。
　　(2) Y-迷宮實(shí)驗(yàn)：四組入臂總次數(shù)（P＞0.05）無顯著差異。CPZ組自發(fā)交替率與正常組相比降低（P＜0.05），DMS沒有改善CPZ誘導(dǎo)的自發(fā)交替率下降。<

7、br>　　(3)社交互動實(shí)驗(yàn)：Control的社交時間大于空籠時間（P＜0.05），其他三組社交時間與空籠時間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。社交時間四組之間兩兩比較結(jié)果：CPZ組與Control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　以上結(jié)果表明，CPZ誘導(dǎo)了小鼠的焦慮樣行為、空間記憶能力下降和社交回避，而DMS干預(yù)可改善焦慮樣行為，對空間記憶和社交回避無顯著改善作用。
　　2. DMS緩解CPZ暴露5周所致的小鼠腦

8、內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞減少及髓鞘損傷
　　用免疫組化標(biāo)記GST-π（π form of glutathione-S-transferase）檢測小鼠不同腦區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLs）的數(shù)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：在皮質(zhì)層部位，四組少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在尾狀核，與Control組相比，其他三組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.05）且三組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在胼胝體及海馬DG、CA3區(qū)， CPZ+Sham組比Contr

9、ol組顯著減少（P＜0.05），CPZ+DMS組與CPZ+Sham組相比較明顯增多（P＜0.05）。
　　髓鞘堿性蛋白免疫組化結(jié)果表明：在皮質(zhì)層、尾狀核部位，四組MBP蛋白表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在海馬DG區(qū)，CPZ+Sham組比Control組顯著減少（P＜0.01）， CPZ+DMS組與CPZ+Sham組相比較明顯增多（P＜0.05）。CA3區(qū)CPZ+Sham組比Control組顯著減少（P＜0.01），CPZ

10、+DMS組與Control組相差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果表明，CPZ處理小鼠可導(dǎo)致部分腦區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少、髓鞘蛋白MBP含量降低，DMS干預(yù)可部分翻轉(zhuǎn)CPZ的這種改變。
　　3. DMS減輕CPZ所致的小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化
　　用免疫熒光標(biāo)記Ibal-1(Calcium binding adaptor molecule-1)檢測小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)層、胼胝體、尾狀核及海馬DG、CA3部位小膠細(xì)胞的數(shù)量變化。統(tǒng)計(jì)結(jié)

11、果顯示，在皮質(zhì)層部位，四組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在胼胝體、尾狀核處CPZ+Sham組比Control組顯著增多（P＜0.01），CPZ+DMS組與Control組相比無顯著差異（P＞0.05），與CPZ+Sham組相比顯著減少（P＜0.01）。海馬DG、CA3處CPZ+Sham組和CPZ+rTMS組均比Control組顯著增多（P＜0.01），但CPZ+DMS組與CPZ+Sham組相比較顯著減少（P＜0.

12、01）。
　　結(jié)果表明，CPZ誘導(dǎo)小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，DMS干預(yù)可以抑制某些腦區(qū)CPZ所致活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　4. CPZ暴露5周導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子水平升高能被DMS顯著抑制
　　用ELISA的方法檢測小鼠腦內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的水平。皮質(zhì)層四組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的表達(dá)無明顯區(qū)別。在海馬TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的表達(dá)結(jié)果如下：CPZ+Sh

13、am組比Control組顯著升高（P＜0.01），CPZ+DMS組與CPZ+Sham組相比較顯著降低（P＜0.01）。在尾狀核區(qū)IL-1β、IL-6的表達(dá)CPZ+Sham組比Control組明顯升高（P＜0.05），CPZ+DMS組與Control組相差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNF-α及IL-10的水平四組間差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1. CPZ暴露5周小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為、空間記憶功能降低和社交回避，4周的 DMS

14、干預(yù)能減輕小鼠的焦慮樣行為，但對空間記憶損害和社交回避無明顯改善作用（？）。
　　2.在CPZ暴露5周后，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，髓鞘堿性蛋白水平降低，DMS緩解這些變化，提示該治療有保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用
　　3.在CPZ暴露5周后，海馬及胼胝體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞被顯著激活，而且海馬區(qū)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抑炎性細(xì)胞因子IL-10的水平均有顯著增加，DMS可降低這些細(xì)胞因子的水平，提示其機(jī)制可能與炎性