SILAC技術(shù)解析KLK7對前列腺癌細(xì)胞的調(diào)控作用.pdf

1、目的:構(gòu)建過表達(dá)KLK7基因的前列腺癌細(xì)胞系22RV1-KLK7，利用基于質(zhì)譜的穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，檢測過表達(dá)KLK7的細(xì)胞系22RV1-KLK7與對照細(xì)胞系之間的差異蛋白，探索KLK7所調(diào)控的蛋白表達(dá)譜，并進(jìn)行部分蛋白的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為闡明KLK7在前列腺癌進(jìn)展中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制提供蛋白分子基礎(chǔ)。
　　方法:1、利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)KLK7的細(xì)胞系22RV1-KLK7和對照細(xì)胞系22R

2、V1-V，并在mRNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證;
　　2、22RV1-KLK7細(xì)胞培養(yǎng)在含13C或15N標(biāo)記的賴氨酸與精氨酸培養(yǎng)基中，22RV1-V細(xì)胞培養(yǎng)在普通培養(yǎng)基，分別提取兩組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，定量和變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫水、酶解、提肽、凍干等步驟，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對兩組樣品的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量;
　　3、對兩組樣品的搜庫結(jié)果進(jìn)行差異分析，獲得22RV1-KLK7和22RV1-V的差異

3、蛋白譜;4、對以上蛋白集合進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找差異蛋白所在的主要功能分類、信號通路、相互作用網(wǎng)絡(luò)等;5、選擇差異蛋白中具有生物學(xué)意義的候選蛋白，在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別驗(yàn)證;6、選擇有生物學(xué)意義的候選蛋白，用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)在組織微陣列芯片中檢測這些蛋白的表達(dá)水平，并與臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，尋找可能影響這些蛋白表達(dá)的指標(biāo)。
　　結(jié)果:1、本研究成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)KLK7的細(xì)胞系22RV1-KLK7，為后續(xù)蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)提

4、供了研究對象;2、質(zhì)譜共定量到2006個(gè)蛋白質(zhì)，有350個(gè)差異蛋白(P＜0.01，fold change ratio＞1.3或＜0.77)，其中上調(diào)蛋白137個(gè)，下調(diào)蛋白213個(gè);3、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，KLK7過表達(dá)后上調(diào)蛋白功能分類主要集中在分解代謝、對化學(xué)刺激的響應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、對凋亡的負(fù)調(diào)控、骨架蛋白介導(dǎo)的過程等功能分類中，下調(diào)蛋白的主要功能分類集中在新陳代謝過程、生物合成、氧化還原等;4、本研究選擇了AGR2和TST兩個(gè)上調(diào)

5、蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示22RV1-KLK7的AGR2和TST的mRNA水平相比22RV1-V顯著提高（21.8±6.31 VS1.21±0.21，P＜0.01;36.7±7.23 VS1.09±0.16，P＜0.01），AGR2和TST蛋白的表達(dá)水平在22RV1-KLK7中顯著升高;5、AGR2和TST蛋白在前列腺癌組織中高度表達(dá)，在BPH或正常前列腺組織不表達(dá)或低表達(dá)，提示其可作為前列腺癌的候選分子標(biāo)志物。
　　結(jié)論:1、本

6、研究成功構(gòu)建了過表達(dá)KLK7基因的前列腺癌上皮細(xì)胞系22RV1-KLK7;2、首次建立了KLK7蛋白在22RV1細(xì)胞系中調(diào)節(jié)的蛋白表達(dá)譜，并初步分析了這些蛋白的生物學(xué)功能，認(rèn)為KLK7蛋白的上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移;3、驗(yàn)證了22RV1-KLK7細(xì)胞系中AGR2和TST轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的升高，證實(shí)了蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性;4、在臨床樣本切片標(biāo)本中進(jìn)一步探索了AGR2和TST蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了AGR2和TST在前列腺癌組織中比正常