鈣蛋白酶抑制劑對(duì)丙烯酰胺致神經(jīng)干細(xì)胞損傷的干預(yù)及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　丙烯酰胺(Acrylamide，ACR)是一種被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的化工原料，除生產(chǎn)和使用ACR過(guò)程中的職業(yè)暴露外，淀粉類食品在高溫(＞120℃)烹調(diào)下也可產(chǎn)生微量ACR。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)資料均已表明，ACR中毒以對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害為主，引起感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)型周?chē)爸袠猩窠?jīng)病變，ACR的神經(jīng)毒性已被人們所認(rèn)識(shí)。相關(guān)研究報(bào)道，ACR可對(duì)神經(jīng)絲(Neurofilaments，NFs)造成損傷，病理結(jié)果顯示ACR中毒模型軸突腫

2、脹、NFs堆積。NFs是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要成分，由NF-L、NF-M、NF-H三種亞單位組成，其中任何一種NFs亞單位表達(dá)缺失或者表達(dá)過(guò)度，都可導(dǎo)致NFs結(jié)構(gòu)或功能紊亂，引起軸漿運(yùn)輸發(fā)生改變，形成軸索病。ACR還可介導(dǎo)神經(jīng)組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度超載可激活鈣蛋白酶(Calpain)活性。但是上述改變之間的聯(lián)系及發(fā)病機(jī)制，尚未研究清楚。
　　假設(shè)ACR引起NFs改變與Calpain活性發(fā)生改變有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)以神

3、經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSCs)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立ACR中毒及鈣蛋白酶抑制劑(Calpeptin，CP)干預(yù)模型，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、Calpain活性，以及NFs含量的變化，探討ACR神經(jīng)中毒的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和治療ACR中毒提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.NSCs的原代培養(yǎng)及鑒定
　　無(wú)菌條件下，取出生24h內(nèi)Wistar大乳鼠的脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal RootGanglion，

4、DRG)進(jìn)行體外細(xì)胞原代培養(yǎng)。采用免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)NSCs特異性表達(dá)物巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)元特異性表達(dá)物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase，NSE)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)進(jìn)行NSCs鑒定。
　　2.ACR中毒及CP干預(yù)模型的建立
　　MTT法測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，逐步確定ACR

5、中毒劑量與CP干預(yù)劑量，建立ACR中毒及CP干預(yù)模型。
　　3.細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及Calpain活性的測(cè)定
　　Fura-2/AM探針負(fù)載法和Calpain SubstrateⅡ底物剩余法分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及Calpain活性。
　　4.NFs含量的測(cè)定
　　聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印跡法(Western Blotting)測(cè)定NFs含量。
　　5.統(tǒng)計(jì)處理
　　采用

6、SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)（方差齊）和Games-Howell檢驗(yàn)（方差不齊）進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.NSCs的原代培養(yǎng)及鑒定
　　NSCs的原代細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)旺盛，7～10d可長(zhǎng)滿25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部。免疫熒光化學(xué)染色法結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的NSCs Nestin染色呈陽(yáng)性，且純度可達(dá)

7、90％以上。相同來(lái)源的細(xì)胞可由1μmol/L的維生素A誘導(dǎo)分化成NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.ACR中毒及CP干預(yù)模型的建立
　　與對(duì)照組比較:ACR組（篩選濃度760μmol/L）、CP組(篩選濃度4μ mol/L)、ACR+CP組(ACR760μmol/L+CP4μmol/L)OD值均低于對(duì)照組，其中ACR組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與ACR組比較:各組OD值均高于ACR

8、組，其中與ACR+CP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）
　　3.細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的測(cè)定
　　與對(duì)照組比較:ACR組、ACR+CP組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度分別升高了47.5％、12.4％(P＜0.05)。CP組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低了2.7％(P＞0.05)。與ACR組比較:ACR+CP組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低了23.8％（P＜0.05）。
　　4.Calpain活性的測(cè)定
　　與對(duì)照組比較:ACR組Calp

9、ain活性升高了23.6％（P＜0.05），CP組、ACR+CP組Calpain活性分別降低了2.8％、4.1％（P＞0.05）。與ACR組比較:ACR+CP組Calpain活性降低了22.4％（P＜0.05)。
　　5.NFs含量的測(cè)定
　　與對(duì)照組比較，CP組、ACR組、ACR+CP組NF-L，NF-M，NF-H含量均升高。ACR組NF-L，NF-M，NF-H分別升高了60.92％、48.31％，35.84％(P＜0.0

10、5)。ACR+CP組NF-L升高了19.87％（P＜0.05），NF-M，NF-H分別升高了6.01％，10.21％(P＞0.05)。與ACR組比較，ACR+CP組NF-L，NF-M，NF-H分別降低了25.51％、28.52％，18.87％(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了以NSCs為受試對(duì)象的ACR中毒及CP干預(yù)模型。
　　2.CP可有效干預(yù)ACR引起的NSCs存活率、Ca2+濃度、Calpain活