基于細胞模型的線粒體DNA單倍型遺傳背景下長壽機制的初步研究.pdf

1、目的：依據(jù)課題組前期研究結(jié)果，在中國人群中線粒體D4a單倍型是長壽人群高頻單倍型，線粒體B4a和N9單倍型是長壽人群低頻單倍型。為了探究線粒體基因組多態(tài)性與壽命調(diào)節(jié)的相關(guān)機制，我們篩選出D4a， B4a和N9單倍型個體，構(gòu)建細胞核背景相同線粒體DNA單倍型不同的單倍型融合細胞模型，對所構(gòu)建的融合細胞模型開展相關(guān)的線粒體功能實驗，比較不同線粒體DNA單倍型融合細胞株的功能差異，以初步探究線粒體DNA單倍型遺傳背景下長壽的相關(guān)機制。

2、　　方法：⑴選取來自同一地區(qū)、年齡為23-30歲健康青年人作為特定的單倍型篩選對象。提取被篩檢對象外周血DNA，經(jīng)特定的DNA序列擴增和特異性限制性內(nèi)切酶作用，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定出三種單倍型個體。⑵抽取特定單倍型個體外周血，提取血小板與去除線粒體的143B骨肉瘤細胞融合，構(gòu)建單倍型融合細胞株。⑶提取融合細胞株包含mtDNA的總DNA，PCR擴增線粒體DNA基因組，對不同線粒體單倍型融合細胞株的線粒體DNA全序列進行分析。⑷對所構(gòu)建的

3、融合細胞模型開展相關(guān)的線粒體功能實驗，比較不同線粒體DNA單倍型融合細胞株的功能差異：氧電極法檢測單倍型融合細胞株線粒體氧化磷酸化呼吸功能；ATP檢測試劑盒檢測單倍型融合細胞株線粒體總的ATP產(chǎn)生量；熒光染料方法檢測單倍型融合細胞株線粒體膜電位水平；多功能酶標儀檢測單倍型融合細胞株ROS生成量。⑸使用熒光定量的方法檢測單倍型融合細胞株線粒體DNA拷貝數(shù)水平。⑹通過RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法檢測單倍型融合細胞株mtDNA編碼呼吸鏈復合體

4、亞基表達水平。⑺應用非變性膠(BNG)的實驗方法對單倍型融合細胞株線粒體呼吸鏈復合體含量進行檢測。⑻通過統(tǒng)計學分析方法，對不同種類的單倍型融合細胞株的功能進行分析比較。
　　結(jié)果：①三組線粒體單倍型細胞的基礎耗氧率、線粒體相關(guān)耗氧率的結(jié)果均為單倍型D4a細胞相對單倍型B4a和N9偏低，P值均小于0.05。②單倍型融合細胞株D4a相比較其他兩種融合細胞其線粒體ATP的總生成量顯著降低，P值分別小于0.05和0.01。③三種單倍型融合

5、細胞株線粒體膜電位水平并無差異。④細胞內(nèi)基礎ROS生成量三種單倍型融合細胞無差異，線粒體特異性ROS生成量，單倍型融合細胞株D4a相對B4a單倍型融合細胞偏低，P值小于0.05。⑤三種單倍型融合細胞株線粒體DNA拷貝數(shù)并無差異。⑥線粒體DNA編碼的大部分呼吸鏈復合體亞基mRNA表達水平長壽高頻單倍型D4a低于長壽低頻單倍型N9，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001。⑦長壽高頻單倍型D4a線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ和Ⅲ含量明顯低于長壽低頻

6、單倍型B4a和N9，P＜0.05， P＜0.01。
　　結(jié)論：⑴通過對所構(gòu)建的細胞模型進行線粒體DNA全序列分析和線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測，確定所構(gòu)建的細胞和背景相同的單倍型融合細胞模型開展的線粒體功能檢測結(jié)果差異僅僅是由不同的線粒體DNA單倍型導致。⑵綜合細胞模型線粒體功能實驗結(jié)果，單倍型融合細胞D4a的線粒體呼吸鏈活性相對B4a和N9較弱，推測可能相對較低的氧化磷酸化功能抑制了ATP的生成，同時也減少了有害物質(zhì)ROS的產(chǎn)生。⑶

7、線粒體復合體mtDNA編碼呼吸鏈復合體亞基mRNA水平及復合體蛋白表達水平不同，從而導致了不同單倍型之間線粒體功能的差異。⑷根據(jù)融合細胞模型的實驗結(jié)果，我們推測長壽高頻單倍型D4a相對長壽低頻單倍型B4a和N9人群更傾向于抵抗衰老、壽命延長的機制可能是:在特定的線粒體DNA單倍型遺傳背景下，該單倍型線粒體呼吸鏈復合體蛋白含量的相對偏低，含量相對較低的氧化磷酸化復合體系統(tǒng)使得其相應的線粒體功能相對減弱，產(chǎn)生的ROS相對減少，氧化應激作用相