沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白SipA導致腸炎的分子機制.pdf

1、沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，它可以引起自限性腸炎、傷寒等疾病。沙門氏菌的致病性主要與染色體上成簇分布的編碼致病相關基因的特定區(qū)域-致病島(Salmonellapathogenicity island，SPI)相關。目前，已在沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)了5個致病島，即SPI-1～SPI-5。其中SPI1和SPI2各自編碼不同的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，TTSS1(typeⅢ secretionsystem1)和TTSS2（typeⅢ secretion system

2、2）。其中SPI1-TTSS與細菌入侵宿主細胞相關，而SPI2-TTSS在細菌的存活和復制過程中發(fā)揮重要作用。
　　SipA是SPI1編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的效應蛋白之一，它可以與actin相互作用。促進G-actin聚合成為F-actin;結合F-actin，導致細胞骨架的重排從而促進沙門氏菌入侵宿主細胞。同時也有研究發(fā)現(xiàn)在動物感染模型中，SipA促進腸炎的發(fā)生。但是，對于SipA導致腸炎的分子機制還不清楚。因此，本課題首先找到S

3、ipA與actin相互作用的具體位點，構建SipA的突變菌株使其失去與actin的作用，然后利用動物感染模型探討突變菌株對腸炎的影響，從而闡明SipA與actin相互作用的結構域是否與其導致腸炎的功能相關。
　　已有研究結果表明SipA497-669是與actin相互作用的最小結構域。在此基礎上，本研究首先構建了一系列SipA的截短突變體，利用共沉的實驗方法驗證這些截短突變體的功能，從而找到SipA與actin相互作用的最小結構域

4、。利用點突變試劑盒，構建SipA的點突變體，利用共沉的實驗方法驗證這些點突變體的功能，從而找到SipA與actin相互作用的位點。研究結果表明SipA514-651是與actin相互作用的最小結構域;SipA635位和637位氨基酸是與actin相互作用的氨基酸位點。同時利用pyrene-actin實驗來研究SipA514-651, SipA635,637對actin聚合臨界濃度的影響，發(fā)現(xiàn)SipA514-651，SipA635,637

5、均可以降低G-actin聚合的臨界濃度，從而促進G-actin的聚合。
　　為了進一步研究SipA的功能，利用同源重組方法構建了沙門氏菌染色體sipA點突變的突變菌株:包括sipAK551A S.Typhimurium, sipAK635A S.Typhimurium，sipAE637WS.Typhimurium，sipAK635AE637W S.Typhimurium，sipA1580SK581A S.Typhimurium。在

6、細胞水平，通過感染HeLa細胞研究這些突變菌株侵襲宿主細胞的能力是否發(fā)生改變。在動物水平，利用小鼠的感染模型研究這些突變菌株是否可以導致嚴重的腸炎。研究結果表明，sipAK635AE637WS.Typhimurium的侵襲力明顯低于野生株;但是，sipAK635AE637WS.Typhimurium引起腸炎程度與野生株相似，也就是說把SipA與actin相互作用的氨基酸位點突變后并不影響其促進腸炎的發(fā)生。以上研究豐富了SPI1-TTSS