探討海珠益肝方從痰論治肝纖維化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究探討海珠益肝方對(duì)Con A(Concanavalin A，刀豆蛋白A)誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化小鼠的療效及可能的作用機(jī)制，探明肝纖維化與leptin(瘦素)、OB-Rb(瘦素受體)、JAK2（Janus Kinase2，Janus激酶2）、STAT3（Signal transducer and activator3，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3）之間的關(guān)系，明確JAK2/STAT3信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。本

2、實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析這一過(guò)程中所涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路，探明海珠益肝方的抗肝纖維化的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治肝纖維化提供新思路和策略。
　　方法：
　　將SPF級(jí)C57BL/6品系小鼠48只，隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組，每組各12只?模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組均采用6mg·kg-1w-1的劑量尾靜脈注射Con A，每周1次，共12周，建立肝纖維化模型。模型復(fù)制成功后，分別給予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)治療，其中

3、秋水仙堿組給予0.25mg·kg-1d-1秋水仙堿，海珠益肝方組給予9.86g·kg-1d-1中藥海珠益肝方，空白對(duì)照組和模型組均給予等劑量的蒸餾水。每日上午9：00和下午15：00各灌胃1次，連續(xù)4周。灌胃給藥結(jié)束第2天早上處死小鼠，收集各組小鼠血液和肝臟、脾臟組織等相關(guān)標(biāo)本。取肝臟組織作病理切片，采用HE染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察并評(píng)定小鼠肝組織病損積分；采用Masson染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織纖維化情況；采用電子顯微鏡

4、觀察各組小鼠肝組織超微病理結(jié)構(gòu)變化。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清ALT(alanine aminotransferase,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(aspartate aminotransferase,天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、小鼠血清及肝組織勻漿上清液TC(total cholesterol，總膽固醇)、TG(triglyceride，甘油三脂)水平、肝組織勻漿MDA(malondialdehyde，丙二醛)及SOD(supe

5、roxide dismutase，超氧化物歧化酶)。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)各組小鼠肝組織勻漿上清液HA(hyaluronieacid，透明質(zhì)酸)、LN(laminin，層粘連蛋白)、PC III(procollagen III，III型前膠原)、CIV（collagen typeⅣ，Ⅳ型膠原）、各組小鼠血清LP(leptin，瘦素)水平。采用RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中l(wèi)eptin mRNA、OB-Rb mRNA

6、、JAK2mRNA、STAT3mRNA轉(zhuǎn)錄水平。采用Western blot(免疫印跡試驗(yàn))法檢測(cè)各組小鼠肝組織中l(wèi)eptin、OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.各組小鼠一般情況比較
　　空白對(duì)照組小鼠一般情況好，行動(dòng)靈活，正常飲食，被皮濃密有光澤，體重增長(zhǎng)明顯。模型組小鼠精神不振，喜臥少動(dòng)，進(jìn)食量較空白對(duì)照組有所減少，且皮毛松弛、雜亂蓬松無(wú)光澤、尿黃，體重增長(zhǎng)緩慢。秋水仙堿組小鼠精神

7、狀態(tài)一般，活動(dòng)較活躍，皮毛欠光滑，體重有所增加。海珠益肝方組小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)較活躍，進(jìn)食量大于模型組及秋水仙堿組，皮毛順滑有光澤，體重增加，僅次于空白對(duì)照組，一般情況均明顯改善。
　　2.各組小鼠肝臟肉眼觀察比較
　　空白對(duì)照組小鼠肝臟質(zhì)地柔軟，表面光滑未見(jiàn)任何斑點(diǎn)、突起、結(jié)節(jié)，顏色略呈深紅色且有光澤，邊緣銳利。模型組小鼠肝臟質(zhì)地較韌，表面見(jiàn)白點(diǎn)，部分肝組織表面粗糙，凹凸不平，顏色變暗紅，邊緣較鈍。秋水仙堿及海珠益肝方

8、組小鼠肝臟質(zhì)地欠柔軟，表面尚光滑，邊緣較銳利，基本未見(jiàn)斑點(diǎn)、突起、結(jié)節(jié)等，顏色接近正常。
　　3.各組小鼠肝、脾指數(shù)的比較
　　在肝指數(shù)方面同空白對(duì)照組相比較，模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組各組小鼠肝指數(shù)均明顯升高(P均<0.05)。模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組脾臟指數(shù)亦較空白對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、海珠益肝方組小鼠肝、脾指數(shù)均有所降低，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

9、05)；與秋水仙堿組在降低小鼠肝及脾指數(shù)方面進(jìn)行比較，海珠益肝方組相關(guān)指標(biāo)降低更多(P<0.05)?
　　4.海珠益肝方對(duì)肝纖維化小鼠肝組織病理的影響
　　光鏡下空白對(duì)照組肝組織清晰，肝細(xì)胞排列以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞漿均勻紅染，細(xì)胞核大小正常，核質(zhì)淡染，未見(jiàn)變性壞死，纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，破壞明顯，肝細(xì)胞索排列不整齊，肝細(xì)胞脂肪變性，部分壞死，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織大量增生，部分

10、假小葉形成，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較多。秋水仙堿組與海珠益肝方組肝臟損傷程度較模型組有所減輕。秋水仙堿組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞有所減輕，肝細(xì)胞排列較整齊，膠原纖維及炎細(xì)胞浸潤(rùn)均減少，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪較空白對(duì)照組明顯增加。海珠益肝方組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞有明顯改善，肝細(xì)胞排列較整齊，膠原纖維及炎細(xì)胞浸潤(rùn)均減少，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴少見(jiàn)。
　　5.海珠益肝方對(duì)肝纖維化小鼠血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA、SOD的影響
　　同空白對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿組、

11、海珠益肝方組小鼠血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA水平均升高(P均<0.05)，而肝組織勻漿SOD水平均下降(P<0.05)；同模型組相比，秋水仙堿組小鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05)，而肝組織勻漿MDA、SOD未見(jiàn)明顯變化；同模型組比較，海珠益肝方組血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA水平均降低(P均<0.05)，而肝組織勻漿SOD水平均升高(P<0.05)；同秋水仙堿組相比，海珠益肝方在降低小鼠血清ALT、AST及肝

12、組織勻漿MDA水平方面優(yōu)于秋水仙堿(P<0.05)，在升高肝組織勻漿SOD水平方面優(yōu)于秋水仙堿(P均<0.05)。
　　6.海珠益肝方對(duì)肝纖維化小鼠血清及肝組織勻漿TG、TC的影響
　　同空白對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組小鼠血清TG、TC水平均降低(P均<0.05)；同模型組比較，秋水仙堿組血清TG、TC水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)；同模型組相比，海珠益肝方組血清TG、TC水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(P均<0.05)；同秋水仙堿組相比，海珠益肝方組在升高小鼠血清TG、TC水平方面優(yōu)于秋水仙堿(P<0.05)。
　　同空白對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組小鼠肝組織勻漿TG、TC均升高(P均<0.05)；同模型組相比，秋水仙堿組肝組織勻漿TG、TC水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)；同模型組相比，海珠益肝方組肝組織勻漿TG水平降低(P均<0.05)；同秋水仙堿組相比，海珠益肝方組在降低小鼠肝組織勻漿TG、TC水平方面

14、優(yōu)于秋水仙堿(P<0.05)。
　　7.海珠益肝方對(duì)肝纖維化小鼠肝組織勻漿HA、LN、PCⅢ、CIV的影響
　　同空白對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組小鼠肝組織勻漿HA、LN、PCⅢ、CIV水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，秋水仙堿組、海珠益肝方組小鼠肝組織勻漿HA、LN、PCⅢ、CIV水平下降(P<0.05)。海珠益肝方組肝組織勻漿HA、LN、PCⅢ、CIV水平顯著性降低，優(yōu)于秋水仙

15、堿組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　8.海珠益肝方對(duì)小鼠血清leptin水平的影響
　　同空白對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿組、海珠益肝方組血清leptin水平均明顯升高(P<0.05)；同模型對(duì)照組相比，秋水仙堿組和海珠益肝方組血清leptin水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。海珠益肝方組血leptin素水平顯著性降低，優(yōu)于秋水仙堿組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

16、
　　9.海珠益肝方對(duì)小鼠肝組織 leptin、OB-Rb mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　同空白對(duì)照組相比較，模型組、秋水仙堿組和海珠益肝方組leptin、OB-Rb mRNA及蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與模型組相比，秋水仙堿組和海珠益肝方組leptin、OB-Rb mRNA及蛋白表達(dá)顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。海珠益肝方組在leptin、OB-Rb mRNA及蛋白表達(dá)方面比秋水仙堿組明顯降低(P<0

17、.05)。
　　10.海珠益肝方對(duì)小鼠肝組織JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　同空白對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿組和海珠益肝方組小鼠肝組織中JAK2 mRNA及蛋白表達(dá)量均高于空白對(duì)照組(P<0.05)。同模型組相比，秋水仙堿組及海珠益肝方組JAK2 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著性降低(P<0.05)。同秋水仙堿組相比，海珠益肝方組JAK2 mRNA及蛋白表達(dá)量有明顯降低(P<0.05)。
　　同空白對(duì)照

18、組比較，模型組、秋水仙堿組和海珠益肝方組小鼠肝組織中STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)量均高于空白對(duì)照組(P<0.05)。與模型組相比，秋水仙堿組及海珠益肝方組STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)量有顯著性降低(P<0.05)。與秋水仙堿組相比，海珠益肝方組STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)量有明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　海珠益肝方可改善肝纖維化模型小鼠的一般情況：如改善模型小鼠的活動(dòng)及體質(zhì)量，改善食欲和飲水等癥狀，顯著降

19、低肝纖維化模型小鼠肝、脾指數(shù)。海珠益肝方有助于肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，減少纖維組織增生、肝細(xì)胞壞死變性以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等。能降低纖維化模型小鼠血清ALT、AST、肝組織勻漿MDA含量，升高肝組織勻漿SOD水平，降低肝組織勻漿中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原含量，具有抗肝細(xì)胞損傷，有效減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)ECM的降解，抑制纖維組織增生，改善肝纖維化小鼠的病理組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到抗肝纖維化的作用。同時(shí)海珠益肝方能調(diào)節(jié)血脂（TG、TC）水平，減少肝細(xì)胞內(nèi)

20、脂肪的堆積，保護(hù)肝細(xì)胞，從而抑制早期肝纖維化的啟動(dòng)。綜上所述，海珠益肝方抗肝纖維化的作用機(jī)制可能為：
　　1.海珠益肝方明顯降低纖維化模型小鼠血清leptin水平，有效的阻止因leptin與OB-Rb結(jié)合而發(fā)揮的誘導(dǎo)HSC活化和增殖作用。
　　2.海珠益肝方明顯抑制纖維化模型小鼠肝組織leptin及其受體表達(dá)，提示Leptin是海珠益肝方抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)之一。
　　3.海珠益肝方能夠降低肝纖維化小鼠肝組織JAK2、