信號分子對革蘭氏陽性病原菌代謝和感染的調控機制.pdf

1、細菌依賴不同的信號調節(jié)系統(tǒng)以響應不斷變化的環(huán)境，實時調整胞內代謝途徑。病原菌的代謝途徑更為復雜，還需要高效的信號傳導系統(tǒng)來介導細菌與宿主的相互作用，或逃避宿主的免疫系統(tǒng)，建立感染。核苷類第二信分子和生物素都是細菌重要的信號分子，調控著包括中心代謝途徑、細胞組成、運動能力、毒力等重要的生理活動。
　　(1) c-di-AMP對金黃色葡萄球菌小菌落突變體代謝和感染的調控機制研究
　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcus

2、aureus)是人類重要的條件致病菌，可引發(fā)皮膚感染和呼吸道疾病。金黃色葡萄球菌小菌落突變體(S.aureus small colony variant，S.aureus SCV)通常是指甲萘醌、血紅素和胸腺嘧啶核苷等營養(yǎng)缺陷型，其生長緩慢，具有耐藥性，在固體培養(yǎng)基上形成微小菌落。胸腺嘧啶核苷依賴型小菌落突變體(S.aureus thymidine-dependent SCV，S.aureus TD-SCV)是由于胸腺嘧啶核苷酸合酶Th

3、yA失活突變引起的，必須通過攝取外源的胸腺嘧啶核苷而生長，通常在經過磺胺甲惡唑和甲氧芐啶長期治療的遺傳性囊性纖維化(cystic fibrosis)肺炎病人體內出現，引起嚴重感染，并造成肺損傷。
　　核苷類第二信使環(huán)二腺苷酸(c-di-AMP)是細菌特有的核苷類第二信使分子，由二腺苷酸環(huán)化酶合成，被特異性的磷酸二酯酶降解，真核生物缺乏合成或降解c-di-AMP的相關蛋白。c-di-AMP參與調控細菌中心代謝、細胞壁合成、滲透壓適應

4、以及抗生素抗性等生理活動，并可與宿主細胞內質網接頭蛋白STING結合，激活天然免疫反應。
　　本研究通過分別敲除S.aureus Newman胸腺嘧啶核苷酸合酶基因thyA和膽色素原合酶編碼基因hemB得到了胸腺嘧啶核苷依賴型-SCVΔthyA和血紅素依賴型-SCVΔhemB。通過巨噬細胞、小鼠感染實驗和Taqman免疫基因芯片分析，發(fā)現ΔthyA相對于野生型菌株和SCV對照菌株ΔhemB，在胸腺嘧啶核苷缺乏時，能夠產生更高濃度的

5、c-di-AMP，激活依賴于STING蛋白的天然免疫反應。而高濃度的c-di-AMP會導致ΔthyA基因組突變率升高，增強細菌的適應性。本研究很好地解釋了TD-SCV能引起高炎癥反應，并造成更嚴重的肺損傷的原因。
　　PstA是一個PⅡ家族信號傳遞蛋白，同時也是c-di-AMP受體蛋白。本研究通過細菌雙雜交實驗和體外酶活測定發(fā)現，PstA在c-di-AMP的存在下能夠和胸腺嘧啶核苷酸激酶相互作用，并促進其激酶活性，促進胸腺嘧啶核苷

6、的利用，幫助ΔthyA在缺乏胸腺嘧啶核苷的環(huán)境下生存。本研究首次揭示了c-di-AMP通過調控胸腺嘧啶核苷利用而參與中心代謝的機制。
　　(2)蘇云金芽胞桿菌c-di-GMP核糖開關Be2 RNA的調控機制研究
　　蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)是一類桿狀、產芽胞的革蘭氏陽性細菌，也是昆蟲致病菌。B.thuringiensis的生活周期主要分為營養(yǎng)期和芽胞形成期，在芽胞形成期可以產生由殺蟲晶體

7、蛋白組成的伴胞晶體，具有廣譜殺蟲活性。目前，B.thuringiensis制劑目前是世界上使用最廣泛的微生物殺蟲劑，研究B.thuringiensis生長代謝、生活周期等有很大的應用價值。
　　環(huán)二鳥苷單磷酸c-di-GMP是廣泛分布于細菌中的重要核苷類第二信使分子，通過結合不同的效應蛋白或核糖開關來調控細菌的毒力、細胞周期、生物被膜形成、運動性等多種生理活動。細菌通過二鳥苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶來控制胞內c-di-GMP的濃度。核

8、糖開關是位于mRNA非翻譯區(qū)的一段具有調控功能的sRNA，典型的核糖開關由適體區(qū)域和下游的表達平臺區(qū)域緊密相連而成。
　　本研究發(fā)現在B.thuringiensis BMB171編碼膠原粘附蛋白(Cap) mRNA的5'-非翻譯區(qū)存在一個c-di-GMP核糖關Bc2 RNA。本研究通過體外轉錄終止實驗，并在c-di-GMP低濃度和高濃度突變株中，通過β-半乳糖苷酶實驗、熒光定量PCR實驗，揭示了Bc2 RNA表達平臺區(qū)的終止子結構

9、會強烈地抑制下游基因cap的轉錄，當結合c-di-GMP后，會引起B(yǎng)c2 RNA變構，并形成抗終止子結構，解除對cap的轉錄抑制。敲除Bc2 RNA會導致cap超表達，從而抑制細菌的運動、胞外多糖的分泌和生物被膜的形成，同時促進細菌的沉降并影響細菌對棉鈴蟲的毒力。本研究首次提出了“抑制-去抑制”模型，并且Bc2 RNA是蠟樣芽胞桿菌群中第一個被實驗驗證功能的c-di-GMP核糖開關。
　　(3)轉錄調控因子BioQ介導的生物素合成

10、調控系統(tǒng)研究
　　結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性傳染病，可以感染人體的各種器官或組織，但主要侵染肺部。大多數抗結核藥物只對生長期的結核分枝桿菌有效，而不能清除潛伏期的結核分枝桿菌，多耐藥結核分枝桿菌的出現使得結核病的防控形勢變得更加嚴峻，現有的抗結核藥物已經不能滿足醫(yī)療的需要，迫切需要從結核分枝桿菌鑒定新的靶標，開發(fā)出新型藥物。
　　生物素是所有生物都必須的維生素

11、。它作為羧化酶的輔因子，對分枝桿菌的中心代謝和脂肪酸合成途徑非常重要，活動期和潛伏期的結核分枝桿菌都必須依賴自身合成生物素而生存，破壞生物素合成途徑會抑制結核分枝桿菌的生長并導致其喪失致病性。哺乳動物不具有生物素合成相關的基因，所以生物素合成途徑已經成為新型抗結核藥物的靶標。
　　本研究以生長迅速、不致病的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)為模式菌株，系統(tǒng)地探究了生物素代謝相關基因的轉錄調控機制，為分枝桿菌生物素代謝研究奠定了

12、基礎。
　　經典的生物調節(jié)系統(tǒng)依賴雙功能酶BirA，一方面作為生物素-蛋白連接酶調控生物素的利用，一方面作為轉錄調控因子控制生物的合成與轉運。分枝桿菌的BirA缺乏轉錄調控因子的功能，我們在恥垢分枝桿菌中鑒定到了一個TetR家族的轉錄調控因子BioQ，它補償了BirA轉錄調控因子的功能，本研究揭示了以BirA和BioQ協同介導的生物素代謝調節(jié)系統(tǒng)。
　　BioQ是TetR家族的轉錄調控因子，本研究通過凝膠阻滯、DNaseⅠ足