水貂阿留申病毒實時定量PCR檢測方法的建立、全基因分析及VP2基因主要功能區(qū)的原核表達(dá)與鑒定.pdf

1、水貂阿留申病(AD)是由細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)貂阿留申病毒屬(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起的免疫系統(tǒng)病理性失調(diào)，主要導(dǎo)致水貂的慢性傳染性疾病。該病主要以水平、垂直兩種形式在世界各地貂群中傳播，使貂的繁殖力和毛皮質(zhì)量下降，給養(yǎng)貂業(yè)造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年，貂阿留申病在我國水貂養(yǎng)殖區(qū)流行的情況時有報道，嚴(yán)重阻礙了我國水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，對國

2、內(nèi)貂阿留申病毒的分離鑒定和分子生物學(xué)特性研究，建立適應(yīng)國內(nèi)毒株的血清學(xué)診斷方法，將會對今后我國開展貂阿留申病的臨床診斷、有效防制及進(jìn)一步深入研究，提供更多的科學(xué)依據(jù)。
　　 在本研究中，首先根據(jù)GenBank上登錄的貂阿留申病毒全基因序列，比對后根據(jù)其保守區(qū)域，設(shè)計一對特異性引物，采用SYBR Green I隨機(jī)結(jié)合滲入法，建立該模式的實時定量PCR檢測方法，構(gòu)建了檢測ADV的標(biāo)準(zhǔn)DNA模版，循環(huán)閾值(Ct值)與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA模

3、板在0.78×101～0.78×108拷貝/μl濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9967。該方法對貂阿留申病毒的檢測具有很高的特異性，其敏感性與常規(guī)PCR相比可以提高100倍，可以用于貂阿留申病毒的快速檢測。
　　 其次，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)毒株ADV-G及強(qiáng)致病性毒株ADV-Utahl的DNA序列設(shè)計并合成五對引物對兩株(ADV-LN1、ADV-LN2)中國毒株進(jìn)行全基因的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體并測序。與已報道

4、歐美毒株進(jìn)行全基因序列比對分析，結(jié)果顯示：ADV-LN1與ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3相比，最高同源性為94.0％(ADV-Utah1)，ADV-LN2與ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3相比，最高同源性為94.9%(ADV-Utah1);遺傳進(jìn)化樹分析，ADV-LN1、ADV-LN2與參考毒株ADV-G、ADV-Utah1、ADV-SL3屬于不同的分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此我們可以得出這樣的結(jié)論：本試驗所分

5、離的中國毒株可能為遠(yuǎn)離歐美的新毒株或是因為ADV高度遺傳多樣性導(dǎo)致歐美毒株在我國長時間演化變異而來。同時，通過對所測毒株與其它細(xì)小病毒屬的遺傳進(jìn)化分析可以看出：ADV與其它四個屬的成員分屬于不同的分支，而ADV之間的遺傳關(guān)系較近，從而進(jìn)一步驗證了國際病毒分類委員會(ICTV)第八次報告新分類體系的合理性。
　　 最后，根據(jù)已完成測序的中國毒株ADV-LN1、ADV-LN2 VP2基因序列，設(shè)計一對特異性引物，應(yīng)用PCR擴(kuò)增，將P

6、CR產(chǎn)物克隆入pMD-18T載體，進(jìn)行測序分析。雙酶切測序后重組質(zhì)粒pMD-18T-M到目的片段連接至原核表達(dá)載體pET-28a(+)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-M。轉(zhuǎn)化至BL21宿主菌，對誘導(dǎo)表達(dá)條件（誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果在37℃，1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)5h可實現(xiàn)重組M蛋白的高效表達(dá)。該重組M蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，Western-blotting分析顯示，重組M蛋白與ADV陽

7、性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。綜上所述，本試驗制備的重組M蛋白具有良好的免疫學(xué)反應(yīng)活性，這為水貂阿留申病毒血清學(xué)診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 總之，本研究初步建立了國內(nèi)貂阿留申病毒株SYBR Green I模式的定量PCR檢測方法，為ADV的快速診斷提供了有效的技術(shù)手段。同時，本試驗完成了兩株國內(nèi)ADV毒株的全序列測定，為研究國內(nèi)ADV病毒株的進(jìn)化規(guī)律和演化特點提供基礎(chǔ)性材料；ADV VP2蛋白主要功能區(qū)基因通過原核表達(dá)載體pET-