鈣庫(kù)操控的鈣離子通道在糖尿病大鼠膀胱收縮功能中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建不同時(shí)間段STZ誘導(dǎo)的DM大鼠動(dòng)物模型。通過(guò)激活或失活SOCCs通道，運(yùn)用離體逼尿肌肌條收縮實(shí)驗(yàn)來(lái)研究SOCCs在DCP疾病中對(duì)膀胱肌條收縮功能的作用。通過(guò)原代逼尿肌細(xì)胞分離培養(yǎng)，培養(yǎng)出原代逼尿肌細(xì)胞。采用SOCCs的激活劑和抑制劑，研究激活或失活該通道后，DM大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞鈣離子濃度的變化。并研究不同糖尿病病程作用下，大鼠膀胱中SOCCs關(guān)鍵分子STIM1和Orai1的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的改變情況。<

2、br>　　方法:
　　1.6-8周雌性S-D大鼠70只，按年齡分為每組10只，其中正常對(duì)照組（normal control，N組）4組，實(shí)驗(yàn)組（diabetes mellitus,DM組）3組。DM組：?jiǎn)未胃骨蛔⑸鋚H4.5，0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液溶解的鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ），50mg/kg。N組：?jiǎn)未胃骨蛔⑸涞润w積的檸檬酸緩沖液。具體分組：
　　DM組：
　?。?）4周實(shí)驗(yàn)組（D

3、M4W組）：注射STZ，成模后4周處死。
　?。?）8周實(shí)驗(yàn)組（DM8W）：注射STZ，成模后8周處死。
　　（3）12周實(shí)驗(yàn)組（DM12W）：注射STZ，成模后12周處死。
　　N組：
　?。?）0周對(duì)照組（N0）：注射緩沖液后3天后處死。
　?。?）4周對(duì)照組（N1）：注射緩沖液后4周后處死。
　?。?）8周對(duì)照組（N2）：注射緩沖液后8周后處死。
　?。?）12周對(duì)照組（N3）：注射緩沖液

4、后12周后處死。
　　注射藥物3天后測(cè)量隨機(jī)血糖三次，血糖值均大于16.7mmol/L，認(rèn)為DM模型構(gòu)建成功。其后觀察處死時(shí)血糖，大鼠體重等指標(biāo)變化，并留取膀胱組織進(jìn)行HE染色，評(píng)估膀胱組織學(xué)改變。
　　2.分別制備8*3*3mm離體逼尿肌肌條，解剖顯微鏡下去除膀胱粘膜及漿膜層，置于kreb’s液中，通過(guò)給予環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic Acid,CPA)激活SOCCs和SKF-96365抑制SOCCs來(lái)觀察各組離

5、體逼尿肌肌條收縮頻率和收縮幅度的變化。
　　3.采用酶消化法來(lái)分離逼尿肌細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。具體使用膠原蛋白酶Ⅱ4mg/ml及牛血清白蛋白（BSA）4mg/ml，在37℃，5％CO2的條件下消化40-60分鐘。觀察所獲得細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式及α-SMA免疫熒光法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞特異性。
　　4.分離培養(yǎng)24h的原代逼尿肌細(xì)胞負(fù)載Fluo-4AM，通過(guò)激活和失活SOCCs通道，在激光共聚焦顯微鏡下觀察和記錄各組逼尿肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度

6、的變化，最后計(jì)算實(shí)測(cè)熒光強(qiáng)度（F1）比背景熒光強(qiáng)度(F0)的變化，即采用F1/F0來(lái)進(jìn)行比較在SOCCs激活和失活后，各組細(xì)胞鈣離子的變化。
　　5.RT-qPCR法和Western Blot法測(cè)定不同時(shí)間DM大鼠膀胱組織STIM1和Orai1分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.DM組大鼠血糖均大于16.7mmol/l，體重連續(xù)降低，與對(duì)照組對(duì)比，DM組大鼠體重下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），膀胱擴(kuò)張明顯，可見(jiàn)膀

7、胱尿潴留，血糖也明顯增高（p＜0.05）。HE染色提示隨著糖尿病進(jìn)展，DM組逼尿肌細(xì)胞增生，肥大，纖維組織排列紊亂，間質(zhì)疏松。
　　2.加入CPA和SKF-96365后離體膀胱逼尿肌肌條收縮頻率變化：
　　加入CPA后，所有實(shí)驗(yàn)組肌條收縮頻率均增加。與對(duì)照組比較，DM4W組和DM8W組肌條收縮頻率明顯增加（DM4W vs N1：t=3.776,p=0.002；DM8W vs N2：t=2.282,p=0.039）。DM三組實(shí)

8、驗(yàn)組之間比較，DM4W組與DM12W，DM8W組與DM12W，均表現(xiàn)為收縮頻率增強(qiáng)（DM12W vs DM4W,p=0.039;DM12W vs DM8W,p=0.012），各個(gè)時(shí)間正常組間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入SKF-96365后，所有實(shí)驗(yàn)組肌條收縮頻率降低。與對(duì)照組比較，DM4W和DM8W組肌條收縮頻率仍較高（DM4W vs N1：t=-3.750,p=0.02；DM8W vs N2：t=-2.593,p=0.021）DM三組之間

9、比較，DM12W組較其他兩組明顯高（DM12W vs DM4W,p=0.004;DM12W vs DM8W,p=0.021），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各個(gè)時(shí)間正常組間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.加入CPA和SKF-96365后離體膀胱逼尿肌肌條收縮幅度變化：
　　在所有實(shí)驗(yàn)組中加入 CPA后，逼尿肌肌條收縮幅度均下降；在加入SKF-96365后，收縮幅度均有所回升，但仍小于沒(méi)加藥前。各組之間逼尿肌肌條收縮幅度比較，差異不明顯，沒(méi)有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.成功分離培養(yǎng)出膀胱逼尿肌細(xì)胞，細(xì)胞3-5天逐漸融合顯片狀生長(zhǎng)，7天左右平滑肌融合達(dá)到80%以上。細(xì)胞呈平滑肌細(xì)胞典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)，α-SMA免疫熒染色陽(yáng)性。
　　5.加入CPA后，激活SOCCs，所有實(shí)驗(yàn)組逼尿肌細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度均增加，DM4W、DM8W與對(duì)照組比較相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（DM4W vs N1：t=4.867, p=0.0002；DM8W vs N2：t=4.203,p=0.001）

11、，DM組之間比較，DM12W較其他兩組明顯降低(DM12W vs DM4W,p=0.001; DM12W vs DM8W,p=0.0004,DM8W vs DM4W,p=0.680），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入SKF-96365后，SOCCs失活，細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度降低，與對(duì)照組比較DM4W, DM8W的熒光相對(duì)強(qiáng)度仍顯著高于對(duì)照組（DM4W vs N1：t=3.141,p=0.007；DM8W vs N2：t=3.871,p=0.002），D

12、M組之間比較，DM12W較其他兩組明顯降低（DM12W vs DM4W,p=0.003;DM12W vs DM8W,p=0.002,DM8W vs DM4W,p=0.914）。
　　6.在DM4W和DM8W組中，與對(duì)照組比較，Orai1mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加（mRNA：DM4W vs N1：t=6.049,p=0.0001；DM8W vs N2：t=4.122, p=0.002蛋白：DM4W vs N1：t=8.862,p=

13、0.001;DM8W vs N2：t=10.803,p=0.0004）。STIM1 mRNA表達(dá)量在DM4W組中顯著增加（t=2.799,p=0.019），STIM1蛋白表達(dá)量在DM4W和DM8W組中顯著增加（DM4W vs N1：t=6.540, p=0.003;DM8W vs N2：t=3.495）。DCP不同時(shí)間比較，Orai1mRNA的表達(dá)量在DM12W組中與其他DM組比較明顯降低（DM12W vs DM4W,p=0.0001;

14、 DM12W vs DM8W,p=0.001, DM8W vs DM4W,p=0.329）；Orai1蛋白表達(dá)量也明顯降低（DM12W vs DM4W,p=0.007;DM12W vs DM8W,p=0.011, DM8W vs DM4W,p=0.717）。STIM1mRNA的表達(dá)量在DM4W組中較其他 DM組明顯增加（DM4W vs DM8W,p=0.013;DM4W vs DM12W, p=0.002, DM8W vs DM12W,

15、p=0.409），而STIM1蛋白表達(dá)量在DM三組間均不同（DM12W vs DM4W,p=0.0003;DM12W vs DM8W,p=0.003,DM8W vs DM4W,p=0.046）。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立SZT誘導(dǎo)的DM大鼠模型。在DCP疾病中，SOCCs參與調(diào)節(jié)了膀胱逼尿肌的收縮功能，SOCCs對(duì)膀胱逼尿肌收縮頻率調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)。
　　2.采用酶消化法成功分離培養(yǎng)了膀胱逼尿肌細(xì)胞，SOCCs參與了