上海地區(qū)不同來源金黃色葡萄球菌分子分型及毒力多樣性.pdf

1、金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）是一種重要的臨床致病菌，能夠引起許多嚴重疾病的發(fā)生。金葡菌還可以通過污染食物引起人群食物中毒，嚴重者可以導致死亡。研究表明，金葡菌的許多毒力因子編碼基因定位于可移動基因元件上，能夠通過基因水平轉移在不同菌株之間傳播，進而影響菌株致病能力。不同來源的金葡菌菌株可能由于特定毒力因子分布不同，其致病能力存在顯著差異。因此探究不同來源的金葡菌菌株遺傳背景差異以及毒力因子編碼基因的分布規(guī)律，對于了解致病性金葡菌菌株的傳

2、播途徑，追蹤其污染源，預防控制金葡菌相關感染疾病的發(fā)生具有重要意義。本論文主要研究內容和結果如下：
　　1.調查上海地區(qū)市售食品中金葡菌的污染情況以及MRSA流行規(guī)律。分別從上海市多個奶牛場、農貿市場以及超市采集607份不同食品樣品，然后按照GB4789.10-2010并結合PCR分子鑒定方法進行金葡菌的分離鑒定。結果表明，共有117份（19.3%）食品樣品受到金葡菌污染，其中鮮肉樣品中金葡菌的污染率最高（28.1%），其次是速凍

3、米面制品（21.3%）和生牛乳（20.2%），而新鮮果蔬（11.8%）和加工豆制品（8.8%）中金葡菌污染率相對較低。在117份金葡菌污染樣品中共分離獲得142株不同金葡菌菌株，然后采用頭孢西丁藥敏紙片法和mecA基因PCR檢測法，篩查食源性MRSA菌株。結果表明，8株菌（5.6%）被鑒定為MRSA，其中7株菌分離自牛奶樣品，1株菌來自于速凍米面制品。
　　2.利用多位點序列分型（MLST）、蛋白A基因分型（spa typing）

4、以及agr基因分型方法，對上海地區(qū)不同食品中污染的142株金葡菌菌株進行群體遺傳多樣性研究。結果表明，在142株食源性金葡菌菌株中共鑒定出26種序列型（ST），16種克隆復合體（CC），34種蛋白A基因型（spa types）以及6種agr等位基因型，其中發(fā)現4個新的ST型（ST2632-ST2635），4個新的spa types（t10761，t10777，t10793和 t10798）以及1個新的agrΙ型變異體。本研究結果發(fā)現CC

5、188-t189-agrΙ（28.2%）是上海地區(qū)食品中污染金葡菌的最流行菌株遺傳型，spa分型方法比 MLST分型方法具有更強的分辨能力，同一個克隆世系的金葡菌菌株具有一致的agr等位基因型。
　　3.25種毒素編碼基因在142株食源性金葡菌菌株中的分布規(guī)律表明，103株（72.5%）食源性菌株都至少攜帶有一種毒素編碼基因。其中，腸毒素基因 sep（43.7%）的攜帶率最高，其次是腸毒素基因 sej（26.1%）和殺白細胞毒素編

6、碼基因pvl（21.1%）。來自于肉制品（80%）和奶制品（89.7%）的金葡菌菌株，攜帶毒素編碼基因的比例明顯高于其它食品來源的金葡菌菌株，表明肉制品以及乳制品中污染的金葡菌菌株對人群具有較高的潛在威脅。在103株毒素編碼基因陽性的食源性菌株中共發(fā)現52種不同毒素基因型，同一個克隆世系的金葡菌菌株可以攜帶有不同的毒素基因型。本研究沒有發(fā)現毒素基因型與菌株遺傳型之間存在明顯相關性，但是不同菌株遺傳型攜帶的毒素編碼基因數目具有明顯差異，如

7、克隆世系 CC5，CC9，CC20，CC50和 CC72平均攜帶至少5個毒素編碼基因。
　　4.腸毒素基因簇（enterotoxin gene cluster，egc）被推測可能促進金葡菌在人體中的定殖生存能力，而金葡菌感染通常由人體共生菌株引起的，因此評價 egc陽性菌株群體的毒力特征十分必要。本研究比較評價了醫(yī)源性和食源性金葡菌菌株群體中攜帶egc locus的多樣性。結果表明，在226株不同來源金葡菌分離株中共檢出43株（1

8、6.17%） egc陽性菌株，統計學分析表明egc在醫(yī)源性（18.55%，23/124）和食源性（14.08%，20/142）金葡菌菌株分中的檢出比例無顯著性差異。本研究共發(fā)現7種不同egc locus基因型，其中egc1型（seg，sei，sem，sen和seo）占39.53%，egc2型（seg，sei，sem，sen，seo和selu）占48.54%，其余5種egc基因型缺失一種或者多種腸毒素編碼基因。
　　5.采用特異PC

9、R檢測了30種毒素編碼基因以及20種黏附相關基因在egc陽性菌株群體中的分布規(guī)律。結果表明，26種毒素編碼基因在43株egc陽性菌株中都能檢出，其中殺白細胞毒素編碼基因pvl在egc陽性菌株中分布最廣（76.7%）。此外，43株egc陽性菌株全部攜帶有4種溶血素編碼基因（hla，hlb，hld和hlg2）。統計分析結果表明，只有毒素休克綜合癥毒素編碼基因 tsst-1在醫(yī)源性和食源性菌株中的分布具有明顯差異。黏附相關基因檢測結果表明，除

10、fnbB（18.6%）外，其余黏附相關基因在 egc陽性菌株中都有很高的分布率（76.7-100%）?？傊?，毒力編碼基因的高攜帶率表明了金葡菌egc陽性菌株對人群公共健康具有重要潛在威脅。
　　6.采用MLST、MLVA和 PFGE三種分型方法，系統評價了43株不同來源的金葡菌 egc陽性菌株的遺傳多樣性，結果鑒定出17種STs，29種MLVA型以及28種PFGE型。其中CC5-agrII是egc陽性菌株中最流行克隆世系（48.8

11、4%）。本研究結果表明 MLVA分型與MLST分型具有較強的相關性，MLVA分型比PFGE和MLST分型具有更強的分辯能力。43株 egc陽性菌株共攜帶有33個毒素基因型和13種黏附基因型，其中26個毒素基因型特異存在于某一個菌株，而屬于同一克隆世系的菌株都具有特定的黏附基因型。
　　7.采用Caco-2細胞體外培養(yǎng)，以及慶大霉素結合溶葡萄球菌酶保護試驗，探究了金葡菌12個不同克隆世系菌株對Caco-2細胞的侵襲能力。結果表明，C

12、C5，CC9，CC25，CC30，CC50，CC59，CC239和CC398等克隆世系都存在Caco-2細胞強侵襲株，而克隆世系CC1，CC20，CC72和CC121則沒有發(fā)現強侵襲株。值得關注的是，與動物特異相關克隆世系MRSA-CC9存在Caco-2細胞強侵襲株，表明動物源MRSA-CC9具有重要的人群潛在致病能力。此外本研究發(fā)現金葡菌菌株的菌膜形成能力與侵襲能力表現出較強的一致性，且泊松相關分析表明金葡菌菌膜形成能力與細胞侵襲力呈