兩個腎性尿崩癥家系AVPR2基因突變的研究.pdf

1、目的：近年來國外學者對X．連鎖隱性遺傳腎性尿崩癥的分子病因作了大量的研究，他們利用分子生物學技術已在不同的家系發(fā)現(xiàn)了180余種不同的基因突變。國內(nèi)學者雖然也報道了若干腎性尿崩癥家系，但對該病致病基因方面的研究進行得很少。我們對于臨床發(fā)現(xiàn)的兩個先天性腎性尿崩癥家系利用多聚酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)直接測序的方法，進行精氨基酸加壓素2型受體(argininevasopressinreceptor2，A

2、VPR2)基因的突變檢測。 方法：經(jīng)過臨床詢問病史，血、尿生化檢驗以及禁水-加壓素試驗診斷兩例“腎性尿崩癥”，并且通過家系調(diào)查確診兩個X．連鎖隱性遺傳的腎性尿崩癥家系。采集臨床診斷為先天性腎性尿崩癥的這兩個家系成員(包括5例患者及其20名親屬)的外周血，按酚．氯仿法提取基因組DNA；在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找到AVPR2基因的DNA序列，應用Primer3軟件對其全部編碼區(qū)及其鄰近內(nèi)含子設計5對引物；通過PCR的方法擴增這5個

3、片段；并對PCR產(chǎn)物進行DNA直接測序，最后用DNAStar軟件對測序結果進行分析，尋找基因突變位點。 結果：應用這兩個家系成員的DNA樣本對上述5個片段分別進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物長度分別為：422bp、480bp、450bp、476bp以及470bp，家系1的所有成員均獲得相應的目的片段，進一步做DNA測序分析顯示，在這3個患者中發(fā)現(xiàn)AVPR2基因的一個突變位點：g．1236T>C，突變位于AVPR2基因的第2個外顯子，即

4、AVPR2基因第1236位點的堿基T被C替換，致使受體蛋白第292位的亮氨酸(CTG)被脯氨酸(CCG)所替代(L292P)。3位患者的母親雖然在臨床上沒有腎性尿崩癥的表型，但是她們的基因測序結果顯示，在其AVPR2g．1236位點的等位基因上同時存在堿基T和C，提示她們?yōu)锳VPR2g．1236T>C的雜合突變。在家系2中，8個正常人均擴增出這5個PCR片斷，測序結果與GenBank中序列相同，但在2個患者中未能擴增出相應的片斷，推測在

5、這一家系中可能存在該基因部分或全部的缺失。重新設計引物，并應用步移法逐段行PCR，最后通過引物對7F／9R擴增出包含缺失范圍在內(nèi)的一段1160bp的產(chǎn)物，進～步測序分析發(fā)現(xiàn)：這一家系的2個患者中存在包含整個AVPR-2基因和鄰近的C1基因的最后一個外顯子及部分的內(nèi)含子在內(nèi)的一個5995bp片斷的缺失以及GAG三個堿基的插入。將缺失片段與GenBank序列作比對，顯示缺失的核苷酸序列的5’端位于L1CAM和AVPR2基因的間區(qū)，3’端位于

6、C1基因的內(nèi)含子-2l中。意即這一5995bp的缺失片段包含了整個AVPR2基因、C1基因的最后一個外顯子(外顯子-22)及最后一個內(nèi)含子(內(nèi)含子-21)的部分。兩位患者的母親及其外祖母也擴增出1160bp的異常PCR產(chǎn)物，提示：她們?yōu)樵撏蛔兊碾s合子。 結論：本研究發(fā)現(xiàn)了中國人X．連鎖隱性遺傳的腎性尿崩癥的兩個新的AVPR2基因突變類型：1．g．1236T>C；2．一個包含整個AVPR2基因和鄰近的C1基因的最后一個外顯子及部分

7、內(nèi)含子在內(nèi)的一個5995bp片斷的缺失以及GAG三個堿基的插入。前者導致AVPR2受體蛋白在292位點上氨基酸的改變(L292P)，使受體第6個跨膜域的亮氨酸被脯氨酸所取代，從而裂解了Q．螺旋結構，由此干擾了AVPR2的正常折疊和轉運，致使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留，而在細胞膜表面的表達水平極低，且不能與AVP結合，從而使腺苷環(huán)化酶活性下降，細胞對水的通透性下降，引起尿崩癥。后者則是由于整個AVPR2基因的缺失使該受體蛋白缺失、沒有表達，由此出現(xiàn)尿