重組魚(yú)精蛋白和Apidaecin的表達(dá)與抗菌活性分析.pdf

1、研究背景
　　魚(yú)精蛋白（Protamine，Pro）是一種主要位于魚(yú)類(lèi)成熟精子細(xì)胞核的堿性蛋白，與DNA形成復(fù)合體即核精蛋白。目前主要通過(guò)天然提取制備，常用于肝素注射過(guò)量而引起的出血，也可用作食品防腐劑。Apidaecin是一類(lèi)小肽，富含脯氨酸，提取于膜翅目昆蟲(chóng)淋巴液，其主要對(duì)革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的殺傷力。
　　魚(yú)精蛋白和Apidaecin在抑菌及防腐應(yīng)用中扮演著極其重要的角色，但產(chǎn)量低限制了兩者的廣泛使用。
　　細(xì)胞

2、珠蛋白（Cytoglobin，CYGB）是本課題組長(zhǎng)期研究的一種六配位血紅素球蛋白，分子量為21.4kDa。CYGB能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高表達(dá)，本研究希望借助于與CYGB融合，實(shí)現(xiàn)魚(yú)精蛋白和Apidaecin的大量制備。
　　研究目的:
　　本論文將先探索表達(dá)魚(yú)精蛋白和Apidaecin多倍體的可行性；其次驗(yàn)證CYGB能否提高魚(yú)精蛋白和Apidaecin多倍體表達(dá)量；最后比較單倍體表達(dá)CYGB-Pro、CYGB-Apida

3、ecin和CYGB-Pro-Apidaecin（CYGB-1PA）的效果。期望獲得最佳的表達(dá)策略，從而大量表達(dá)魚(yú)精蛋白和Apidaecin，為規(guī)模化生產(chǎn)兩者奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　?。?）利用基因工程手段，以同尾酶技術(shù)構(gòu)建魚(yú)精蛋白和Apidaecin多倍體4Gene、Gene4、2APA三種序列，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)；
　　（2）將（1）中三個(gè)序列分別與CYGB融合，構(gòu)建CYGB-4Gen

4、e、CYGB-Gene4、CYGB-2APA，IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE及Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)；
　?。?）優(yōu)化基因序列，構(gòu)建融合基因CYGB-1PA、CYGB-2PA，驗(yàn)證能否正確表達(dá)二倍體；
　　（4）構(gòu)建單倍體融合基因CYGB-Pro、CYGB-Apidaecin，將CYGB-Pro、CYGB-Apidaecin、CYGB-1PA共同誘導(dǎo)表達(dá)，得出最佳的表達(dá)方式；
　?。?）對(duì)表達(dá)效果

5、較好的融合基因以乳糖進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，純化蛋白后進(jìn)行抑菌活性分析。
　　研究結(jié)果：
　?。?）4Gene、Gene4、2APA三種序列均沒(méi)有明顯目的蛋白表達(dá)；
　?。?）CYGB-4Gene、CYGB-Gene4、CYGB-2APA均有表達(dá)，但是實(shí)際大小與理論值相差較大，推測(cè)翻譯提前終止；
　?。?）SDS-PAGE及Western Blotting鑒定知：CYGB-1PA、CYGB-2PA表達(dá)均正確，CYGB

6、-1PA表達(dá)較好，而CYGB-2PA表達(dá)量較低；
　?。?）CYGB-Pro、CYGB-Apidaecin、CYGB-1PA共表達(dá)得知：三者均正確表達(dá)，且CYGB-Pro表達(dá)極好；
　?。?）CYGB-4Gene以乳糖大量誘導(dǎo)表達(dá)，純化后，其表達(dá)量為4.145mg/L，BrCN裂解后以抑菌圈法分析知對(duì)所選革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌以及巴斯德畢赤酵母GS115均有明顯抑菌活性；
　　（6）乳糖大量誘導(dǎo)表達(dá)CYGB-Pro，Br

7、CN裂解后提取魚(yú)精蛋白，粗魚(yú)精蛋白量為11.528mg/L（還需進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝和蛋白純度），試管法分析所得魚(yú)精蛋白有明顯抑菌活性。
　　結(jié)論：
　　本論文證實(shí)了直接表達(dá)魚(yú)精蛋白和Apidaecin多倍體難以實(shí)現(xiàn)，以CYGB輔助的多倍體會(huì)翻譯提前終止。經(jīng)過(guò)基因序列多次優(yōu)化，首次正確融合表達(dá)了CYGB-1PA和CYGB-2PA。同時(shí)也首次實(shí)現(xiàn)了CYGB-Pro以及CYGB-Apidaecin的融合表達(dá)，表達(dá)效果較好。大量表達(dá)