蛋白質(zhì)的表達(dá)純化、晶體分析和活性研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜且高度有序的動(dòng)態(tài)過(guò)程，必須借由一套精密調(diào)控系統(tǒng)即差異表達(dá)基因來(lái)保證這個(gè)復(fù)雜過(guò)程的精確性。因此，分離、克隆不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因，并通過(guò)各種功能實(shí)驗(yàn)深入研究它們調(diào)控精子發(fā)生的過(guò)程，將對(duì)精子發(fā)生機(jī)理的闡明起到重大的推動(dòng)作用，同時(shí)也將對(duì)人類的生殖健康做出巨大貢獻(xiàn)。
　　 結(jié)構(gòu)生物學(xué)是發(fā)展日新月異的一門(mén)學(xué)科。即通過(guò)純化蛋白質(zhì)、篩選和優(yōu)化晶體、X射線衍射（或其他技術(shù)）等手段獲得蛋白質(zhì)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)并對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行

2、解析。結(jié)構(gòu)信息的獲得常會(huì)帶來(lái)功能研究上的提示與突破，因此在研究中將結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)合起來(lái)是目前科研的趨勢(shì)。
　　 本論文研究即包含以上關(guān)注的兩個(gè)方面，研究?jī)?nèi)容分為兩部分，分別介紹如下：
　　 第一部分：RSA-14-44和相關(guān)蛋白質(zhì)的純化及其GTPase活性測(cè)定
　　 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，我們利用激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser CaptureMicrodissection，LCM）和抑制性消減雜交技術(shù)（Supp

3、ressive Substractive Hybridization，SSH）成功地捕獲了大鼠生精過(guò)程中的初級(jí)精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞，并構(gòu)建成功了圓形精子細(xì)胞消減初級(jí)精母細(xì)胞的消減cDNA文庫(kù)（RSA），進(jìn)而從中篩選出差異表達(dá)基因。本研究中所涉及的RSA-14-44/mRSA-14-44就是通過(guò)上述篩選所得到的一個(gè)新基因。該基因在GenBank中的登錄號(hào)為AY149343，編碼序列長(zhǎng)度為582bp，編碼一個(gè)由193個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

4、經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)中具有Rho-GTPase保守結(jié)構(gòu)域。
　　 生物信息學(xué)分析結(jié)果同時(shí)顯示，RSA-14-44的氨基酸序列與Rho GTPase家族中的RhoA like亞家族成員高度同源。在本部分工作中，我們純化出了GST-RSA-14-44蛋白，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該蛋白具有GTPase活性，因此確定RSA-14-44是RhoA like亞家族的一個(gè)新成員。同時(shí)，我們還純化了RSA-14-44的截短體及其他相關(guān)蛋白質(zhì)并

5、進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的其他重要功能。
　　 因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)生物學(xué)的相關(guān)研究手段如克隆構(gòu)建、表達(dá)純化等技術(shù)已比較成熟，我們還利用該平臺(tái)純化了Jab1、Smad3等蛋白，有效的推動(dòng)了這些蛋白質(zhì)的功能研究工作。
　　 第二部分：騰沖嗜熱厭氧菌新型半乳糖變旋酶TTE1925的表達(dá)純化及晶體分析
　　 新型半乳糖變旋酶（tte1925）基因是錢(qián)忠等（北京基因組研究所）利用生物信息學(xué)分析結(jié)合生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，在騰沖嗜熱厭氧菌（T

6、hermoanaerobacter tengcongensis，T。tengcongensis）半乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)功能尚未注釋的基因（hypothetical protein），該蛋白質(zhì)在GenBank的序列號(hào)為NP_623500，開(kāi)放閱讀框編碼301個(gè)氨基酸，通過(guò)生物信息學(xué)分析，TTE1925被初步定義為半乳糖變旋酶（GalM）。隨后利用旋光儀實(shí)驗(yàn)，TTE1925被生物學(xué)鑒定為半乳糖變旋酶。但是由于其在氨基酸序列上的高度變異性，

7、與目前已知的半乳糖變旋酶在序列上不具有同源性。基于該蛋白質(zhì)的特殊性，本研究通過(guò)將tte1925基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，將菌落PCR和測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）后獲得表達(dá)菌株。該菌株經(jīng)異丙基-13-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)高效表達(dá)出帶有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽的可溶性融合蛋白，經(jīng)過(guò)GlutathioneSepharoseTM4B親和層析、Resource Q6mL離子交換層