人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)和神經(jīng)誘導(dǎo)分化過程中基因組遺傳變異的動態(tài)變化.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)通常來源于胚胎發(fā)育過程中囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(InnerCellMass，ICM)，具有發(fā)育全能性的特點，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)最重要的種子細(xì)胞之一。以干細(xì)胞為核心的再生醫(yī)學(xué)越來越受到科學(xué)家及臨床工作者的關(guān)注。
　　 hESCs通過移植、分化與組織再生促進(jìn)機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)，治療疾病。盡管hESCs發(fā)展前景很好，但是仍存在安全風(fēng)險。目前尚未明確hESCs在長期傳代培養(yǎng)

2、和誘導(dǎo)分化過程中基因組是否存在動態(tài)變異以及遺傳特征是否穩(wěn)定。因此，要把hESCs應(yīng)用于臨床治療首先要明確hESCs是否安全可靠。深入探索hESCs種子細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性及相關(guān)分子機(jī)制，對于hESCs的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用具有重要意義。但是目前國內(nèi)外尚缺乏從建系、長期傳代培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化過程中對遺傳變異的系統(tǒng)研究。
　　 本研究認(rèn)為在建系早期就要明確hESCs的遺傳特征，伴隨傳代培養(yǎng)，遺傳變異是否會增加，在后續(xù)的誘導(dǎo)分化過程中遺傳變異

3、的變化是否會繼續(xù)存在，這是hESCs臨床應(yīng)用的瓶頸。因此利用輔助生殖技術(shù)中人的廢棄胚胎建立hESCs，在傳統(tǒng)G顯帶鑒定核型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)芯片對hESCs基因組DNA進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)檢測，明確建系早期hESCs的遺傳變異特征;繼而應(yīng)用SNP芯片監(jiān)測人胚胎干細(xì)胞長期傳代培養(yǎng)過程中基因組遺傳變異的動態(tài)變化和甲基化芯片檢測基因組的甲基化狀態(tài)，對每株hE

4、SC系都進(jìn)行了SNP、拷貝數(shù)變異（Copy Number Variants，CNV）、雜合性缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH)和甲基化的檢測，全面評價了hESCs基因組的分子遺傳學(xué)變化;利用擬胚體途徑將hESCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，提取基因組DNA應(yīng)用SNP芯片檢測不同傳代數(shù)的克隆誘導(dǎo)而來的神經(jīng)前體細(xì)胞基因組變異特征，研究誘導(dǎo)分化過程對基因組遺傳變異的影響，為今后細(xì)胞移植的安全性提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

5、r>　　 本研究的主要創(chuàng)新點:①用異常原核受精卵和劣質(zhì)胚胎建立正常核型的hESC系，并用SNP芯片對hESC系進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定。②研究混合飼養(yǎng)層長期傳代培養(yǎng)過程中hESC基因組SNP、CNV、LOH和甲基化的變化。③研究hESC系向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，神經(jīng)前體細(xì)胞基因組的SNP、CNV、LOH的變化。經(jīng)查新未見相同研究。
　　 第一部分：人廢棄胚胎來源的胚胎干細(xì)胞系的建立及遺傳變異的鑒定
　　 目的:

6、　　 建立hESC系并進(jìn)行全面鑒定。建立hESC系的SNP芯片檢查方法，分析hESC系的基因遺傳特征，建立hESC系與已知疾病相關(guān)的基因組CNV遺傳信息檔案。
　　 方法:
　　 1.收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心體外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization Embryo Transfer,IVF-ET）或卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（Introcy to Plasm Sperm Inject

7、ion Embryo Transfer,ICSI-ET）患者的新鮮廢棄胚胎，序貫培養(yǎng)到囊胚階段?；颊吆炇鹬橥鈺?。
　　 2.采用機(jī)械法分離囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將其種植于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人包皮成纖維細(xì)胞按1∶1混合的飼養(yǎng)層上，機(jī)械傳代法傳代純化，建立hESC系。
　　 3.對hESC系進(jìn)行全能性鑒定，用免疫熒光檢測表面抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表達(dá);RT-PCR法檢測OCT4(P

8、OU5F1)、SOX2和NANOG基因mRNA的表達(dá)。
　　 4.傳統(tǒng)G顯帶進(jìn)行核型分析，同時應(yīng)用高分辨率Infinium High-Density Human Cyto SNP-12DNA芯片檢測hESC基因組DNA的CNV和LOH，分析hESCs和疾病相關(guān)的分子遺傳學(xué)背景。
　　 結(jié)果:
　　 1.432名IVF/ICSI周期患者的772枚新鮮廢棄胚胎，經(jīng)序貫培養(yǎng)形成117個囊胚，囊胚形成率15.2％，優(yōu)質(zhì)囊

9、胚58枚，優(yōu)質(zhì)囊胚率7.5％。分離擴(kuò)增117枚ICM，共建立6個hESCs細(xì)胞系:0PN來源1個系，2PNⅣ級胚胎來源1個系，1PN來源2個系，3PN來源2個系。
　　 2.6個hESCs細(xì)胞系表面抗原SSEA-1呈陰性表達(dá)，SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81呈陽性表達(dá)，PCR檢測OCT4(POU5F1)、SOX2和NANOG基因的mRNA均有表達(dá)。
　　 3.6個hESCs體外可以分化為擬胚體，并且表達(dá)三

10、胚層標(biāo)記物神經(jīng)巢蛋白、心肌肌鈣蛋白和甲胎蛋白;體內(nèi)可以分化為畸胎瘤。
　　 4.NO19P25(3PN)、NO20P24(3PN)和NO21P17(2PN(Ⅳ))G顯帶核型分析結(jié)果均為46，XY。
　　 5.NO19P25和NO20P24分別有7個缺失，NO21P17有2個擴(kuò)增、5個缺失。NO20P24的11p11.2-11p11.12上存在2.98Mb的缺失。
　　 6.NO20P24的Xq28有一個長度為2.

11、2Mb的LOH，涉及相關(guān)基因84個;NO21P17的11p11.2-11p11.12有一個長度為3.6Mb的LOH，涉及相關(guān)基因16個。
　　 結(jié)論:
　　 1.異常原核受精卵可以發(fā)育成優(yōu)質(zhì)囊胚，建立正常核型的hESC系。
　　 2.用SNP芯片分析hESC系的分子細(xì)胞遺傳學(xué)特征，可以為其提供與已知疾病相關(guān)的“身份鑒定”。
　　 第二部分：人胚胎干細(xì)胞長期傳代培養(yǎng)過程中基因組遺傳變異和甲基化的動態(tài)變化

12、r>　　 目的:
　　 對建立的hESC系進(jìn)行長期傳代培養(yǎng)，探討在培養(yǎng)過程中hESCs的SNP、CNV、LOH和甲基化的動態(tài)變化。
　　 方法:
　　 1.玻璃化冷凍復(fù)蘇Zh1-P16和Zh21-P17，在混合飼養(yǎng)層MMC上長期傳代培養(yǎng)，每5～7天用機(jī)械法傳代。
　　 2.分別提取Zh1系P20/P27和Zh21系P27/P60/P68代的基因組DNA，行高分辨率的114萬SNPs位點Illumina

13、Human omni1-quad beadchip基因分型芯片檢測，分析SNP、CNV、LOH的變化。
　　 3.利用上述樣品DNA進(jìn)行Infinium Human Methylation 27 Bead Chip甲基化芯片檢測，分析甲基化的變化。
　　 4.通過KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)分析CNV和甲基化的相關(guān)基因通路及基因的功能。
　　

14、 結(jié)果:
　　 1.Zh1-P20、Zh1-P27G-顯帶核型分析為46，XX，F(xiàn)ISH分析為二倍體46，XX;Zh21-P27、Zh21-P60和Zh21-P68G-顯帶核型分析為46，XY，F(xiàn)ISH分析為二倍體46，XY。
　　 2.早期傳代數(shù)Zh1P20-＞27的SNP變異率為4.01×10-6，早晚期傳代數(shù)Zh21P27-＞60的SNP變異率為1.46×10-5，后者高于前者。
　　 3.Zh21-P2

15、7全基因組CNV的缺失比例為99.38％，擴(kuò)增比例為0.62％;Zh1-P20缺失比例為96.77％，擴(kuò)增比例為3.23％;與千人基因組計劃中國北京漢族人（TheHanPeopleInBeijingOfChina，CHB）(91.20％，8.80％)相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4.在Zh21-P60/27中篩選出＞0.5kb的5個CNV，在Zh21-P68/60晚期代數(shù)，共有10個＞IMB的CNVs。CNV相關(guān)基因通路分析:涉及到

16、三個基因的代謝通路，GABRG1、NEGR1和FOLZH1。
　　 5.hESCs長期培養(yǎng)中，Zh21的P27/60有25個大于1Mb的LOH變異，同一個系的P60/68有13個LOH變異。在Zh1-P20/27，3q26.1有一個1.48Mb的LOH。
　　 6.hESCs長期培養(yǎng)過程中甲基化的分析，晚期代數(shù)Zh21P68相對于早期代數(shù)Zh21P27，高甲基化位點有196個，低甲基化的位點有91個。
　　 7.

17、甲基化顯著性差異基因分析:晚期代數(shù)Zh21P68與早期代數(shù)Zh21P27比較共有10個顯著性差異基因，主要和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.長期傳代培養(yǎng)過程中hESCs存在SNP、CNV和LOH的動態(tài)變化，在早期傳代過程中hESCs能夠保持基因組穩(wěn)定性，隨著傳代次數(shù)的增加，基因組的不穩(wěn)定性也逐漸增強。
　　 2.臨床應(yīng)用之前，核型穩(wěn)定的hESCs在傳代過程中也應(yīng)該間隔合適的傳代代數(shù)用高

18、分辨率的方法監(jiān)測基因組的染色體特征。
　　 3.hESCs長期培養(yǎng)過程中晚期代數(shù)的細(xì)胞中高甲基化位點增多。
　　 4.分析遺傳變異相關(guān)基因的通路，有助于理解變異基因的生物學(xué)功能。
　　 第三部分：不同傳代數(shù)的人胚胎干細(xì)胞神經(jīng)誘導(dǎo)分化的遺傳變異研究
　　 目的:
　　 探討體外神經(jīng)誘導(dǎo)分化過程對基因組變異CNV的影響，為今后細(xì)胞移植的安全性提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　

19、 1.體外通過擬胚體途徑將hESCs定向分化為神經(jīng)球和神經(jīng)前體細(xì)胞，光鏡觀察神經(jīng)誘導(dǎo)分化細(xì)胞形態(tài)。
　　 2.免疫熒光檢測神經(jīng)球標(biāo)志物Nestin和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Nestin和Map2。
　　 3.提取神經(jīng)球的基因組DNA，通過Infinium High Density Human Cyto SNP-12DNA Bead Chip芯片檢測誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)前體細(xì)胞的遺傳變異（CNV和LOH）。
　　 結(jié)

20、果:
　　 1.光鏡下MMC飼養(yǎng)層上hESCs細(xì)胞呈克隆樣巢狀生長，經(jīng)過EB培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，克隆團(tuán)塊變?yōu)榍蛐螒腋≡谂囵B(yǎng)液中，經(jīng)過神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基和神經(jīng)球培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，形成神經(jīng)球，貼壁分化的細(xì)胞逐漸向神經(jīng)細(xì)胞樣改變形態(tài)，呈雙極或多極并有分枝樣突出或者突觸。
　　 2.分化后期貼壁分化的細(xì)胞Nestin和Map2免疫熒光染色陽性，呈現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞特征。
　　 3.神經(jīng)誘導(dǎo)分化前后，Zh1早期代數(shù)穩(wěn)定存在9p21.1的

21、雜合性缺失和10p12.31的單拷貝增加，誘導(dǎo)后神經(jīng)球中CNV長度分別增加0.01和0.02Mb，涉及相同的基因。
　　 4.NO21P41神經(jīng)球出現(xiàn)13q13.2-q13.3長度為0.63Mb的缺失，涉及到3個基因NBEA、MAB21L1和MIR548F5。NO21p71神經(jīng)球出現(xiàn)20q11.21長度為0.75Mb的擴(kuò)增，涉及到14個基因DEFB115-124、REM1、NCRNA00028、HM13、PSIMCT-1、ID1

22、、COX4I2、BCL2L1、TPX2、MYLK2、FOXS1、TTLL9、PDRG1和XKR7。
　　 5.Zh1系P37克隆、P27、P32、P33、P34、P38、P42、P44和P49神經(jīng)球共9個樣品均有Xp11.21-p11.1上3.2Mb的LOH;Zh21系P17、P41克隆與P41、P71神經(jīng)球共4個樣品均有11p11.2-p11.12上3.6Mb的LOH。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外經(jīng)EB途徑成

23、功將Zh1和Zh21hESCs定向分化為神經(jīng)球和神經(jīng)前體細(xì)胞。
　　 2.誘導(dǎo)分化過程中的CNV可以由hESCs繼承而來，雖然CNV相關(guān)基因不變，但長度會發(fā)生微小變化，早期代數(shù)會略有增加，而晚期代數(shù)呈現(xiàn)動態(tài)變化。
　　 3.神經(jīng)誘導(dǎo)分化過程會產(chǎn)生新的CNV，晚期代數(shù)的細(xì)胞出現(xiàn)適應(yīng)性生長。
　　 4.不僅需要嚴(yán)密監(jiān)測傳代培養(yǎng)的hESCs，也要監(jiān)測相應(yīng)傳代數(shù)hESCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，探索分化細(xì)胞的遺傳特征，確保移