枳椇肉質(zhì)果梗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性研究.pdf

1、枳椇(Hovenia dulcis)為鼠李科(Rhamnaceae)高大落葉喬木，在我國分布廣泛。枳椇屬植物中的肉質(zhì)果梗作為中藥使用已有上千年的歷史，其具有清熱利尿，止渴除煩和解酒毒等功效?，F(xiàn)代藥理證明，枳椇肉質(zhì)果梗具有解酒護肝、抗脂質(zhì)過氧化以及抗疲勞等功能活性。
　　 目前對枳椇肉質(zhì)果梗的研究主要集中在其粗提物和小分子化合物，而關(guān)于肉質(zhì)果梗多糖的研究則未見報道。本論文以枳椇肉質(zhì)果梗為原料，主要包括提取條件優(yōu)化、分離純化、理化性

2、質(zhì)、初步結(jié)構(gòu)分析、抗氧化活性、抗急性酒精性肝損傷活性、免疫調(diào)節(jié)活性以及抑制腫瘤細胞增殖活性。主要結(jié)果如下:
　　 1、枳椇肉質(zhì)果梗多糖提取條件優(yōu)化
　　 選擇提取溫度、提取時間和液料比3個因素分別進行單因素實驗，在此基礎(chǔ)上設(shè)計三因素五水平的響應(yīng)面法實驗進行提取條件的優(yōu)化，通過Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行處理，得到枳椇肉質(zhì)果梗多糖最佳提取條件為:提取溫度96℃，提取時間200min，液料比21 mL/g，提取次

3、數(shù)3次。在此條件下多糖的得率為10.47％。
　　 按最優(yōu)提取條件提取得到的枳椇肉質(zhì)果梗多糖，經(jīng)過凍融法去除淀粉和S-8大孔吸附樹脂法脫色后，溶解性提高，顏色變淺，最終的粗多糖得率為3.3％。
　　 2、枳椇肉質(zhì)果梗多糖分離純化、理化性質(zhì)及初步結(jié)構(gòu)分析
　　 采用DEAE-纖維素陰離子交換柱色譜法和葡聚糖G-100凝膠過濾柱色譜法對枳椇肉質(zhì)果梗粗多糖進行兩步純化，獲得三個純化組分HDPS-1、HDPS-2和HDP

4、S-3，得率分別是29.64％、10.93％和18.20％。采用HPLC法對HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的純度進行進一步鑒定，結(jié)果表明HDPS-1、HDPS-2和HDPS-3三者都是均一的多糖組分。其相對重均分子量分別為:234.75，69.72和52.50 kD。
　　 采用苯酚硫酸法、間羥聯(lián)苯法、氯化鋇-明膠法、考馬斯亮藍法對粗多糖、HDPS-1、HDPS-2和HDPS-3中總糖含量、糖醛酸含量、硫酸基含量、蛋白

5、質(zhì)含量進行了測定。結(jié)果表明，粗多糖、HDPS-1、HDPS-2和HDPS-3中總糖含量分別是68.13％、86.94％、73.62％和69.41％;糖醛酸含量分別是16.54％、2.10％、8.80％和43.95％;硫酸基含量分別是8.45％，2.68％，2.98％和3.53％。另外，蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果表明粗多糖含有1.50％蛋白質(zhì)，而純化各組分則不含有蛋白質(zhì)。GC分析表明，粗多糖由7種單糖組成，分別為鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘

6、露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比是19.50∶31.4∶1.53∶3.68∶1.58∶12.88∶29.25;HDPS-1，HDPS-2和HDPS-3的主要單糖組成為鼠李糖，阿拉伯糖和半乳糖，三個樣品中這三種單糖所占的摩爾百分比分別是HDPS-1:42.04％,17.00％和30.91％; HDPS-2:5.32％,48.76％和44.14％; HDPS-3:30.77％,37.76％和22.32％。
　　 紅外光譜掃描表明， H

7、DPS-1、HDPS-2和HDPS-3含有多糖的特征吸收峰。高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果表明，三個純化組分HDPS-1，HDPS-2，HDPS-3均是以1→3或1→3，6或1→3，4或1→3，4，6或1→2，3或1→2，4或1→2，4，6或1→2，3，4鍵連接糖基為主，分別占各自總摩爾數(shù)比例為59％，54％和61％。
　　 3、枳椇肉質(zhì)果梗多糖抗氧化活性和抗急性酒精性肝損傷活性
　　 采用化學(xué)分析的方法評價了枳椇肉質(zhì)果

8、梗粗多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，枳椇肉質(zhì)果梗粗多糖具有清除超氧陰離子、抗脂質(zhì)過氧化以及螯合金屬離子的能力。在此基礎(chǔ)上，采用酒精灌胃制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，評價了枳椇肉質(zhì)果梗粗多糖體肉抗急性酒精性肝損傷的效果。結(jié)果表明，提前給藥枳椇肉質(zhì)果梗粗多糖20天，能顯著減弱因肝損傷引起的血液中ALT和AST含量的升高，顯著增強酒精性肝損傷小鼠肝臟中抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性、減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成。結(jié)果表明，枳椇肉質(zhì)果梗粗

9、多糖可能是通過增強體內(nèi)抗氧化酶的活性、直接清除ROS、抑制脂質(zhì)過氧化以及螯合金屬離子等途徑來拮抗氧化應(yīng)激引起的急性酒精性肝損傷。
　　 4枳椇肉質(zhì)果梗多糖免疫調(diào)節(jié)活性
　　 首先采用體外細胞培養(yǎng)模型初步評價了枳椇肉質(zhì)果梗多糖三個純化組分的免疫調(diào)節(jié)活性。并根據(jù)體外實驗的篩選結(jié)果，對于具有相對最強體外免疫調(diào)節(jié)活性的純化組分，進一步研究了其在小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)活性。
　　 體外免疫實驗結(jié)果顯示，HDPS-1，HDPS-

10、2和HDPS-3均能在不同程度上刺激脾細胞增殖、促進巨噬細胞NO的合成、增強巨噬細胞酸性磷酸酶活性和巨噬細胞吞噬中性紅的能力，說明HDPS-1，HDPS-2和HDPS-3均具有不同程度的體外免疫調(diào)節(jié)活性。對實驗結(jié)果的對比分析發(fā)現(xiàn)，免疫調(diào)節(jié)活性在三個純化組分之間存在顯著差異，從強到弱依次是:HDPS-1＞HDPS-2＞HDPS-3。
　　 HDPS-1的體內(nèi)免疫實驗結(jié)果顯示，不同劑量的HDPS-1均可以拮抗環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠脾臟萎

11、縮，提高脾臟中的溶菌酶活性，一定劑量的HDPS-1還能顯著的提高免疫抑制小鼠血清中IL-6和IFN-γ水平。此外，HDPS-1體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性具有很強的劑量依賴性，即在中、低濃度時具有促進免疫的作用，而在高濃度時具有一定程度的免疫抑制作用。這些結(jié)果表明，HDPS-1可能是通過調(diào)控與細胞免疫和體液免疫相關(guān)細胞因子的分泌來發(fā)揮其雙向免疫調(diào)節(jié)活性。
　　 5枳椇肉質(zhì)果梗多糖抑制腫瘤細胞增殖活性
　　 采用MTT法考察了HD

12、PS對三種腫瘤細胞（A549、HepG2和BGC-823）的抑制增殖作用，并選取其中對HDPS最敏感的腫瘤細胞株，進一步研究HDPS對該細胞株細胞形態(tài)以及細胞凋亡的影響。
　　 實驗結(jié)果表明，HDPS-1，HDPS-2和HDPS-3對腫瘤細胞A549和Hep G2均無明顯的增殖抑制作用，但對腫瘤細胞BGC-823細胞抑制增殖效果顯著。三個組分對腫瘤細胞BGC-823的增殖抑制作用均呈顯著的量效和時效關(guān)系，在給藥時間72h、給藥濃

13、度320μg/mL時，HDPS-1，HDPS-2和HDPS-3的抑制率分別為:93.94％，84.38％和78.33％。其中HDPS-1具有最強的增殖抑制作用，在給藥時間為24，48和72h時，HDPS-1的半數(shù)抑制濃度分別為:207.05，44.13和5.02μg/mL。
　　 細胞形態(tài)學(xué)研究證明HDPS-1可以顯著的抑制腫瘤細胞BGC-823的生長，且隨劑量的增長細胞密度逐漸下降，細胞萎縮變形直至發(fā)生凋亡;Hoechst33