G-CSF對(duì)壓力超負(fù)荷下小鼠心室重構(gòu)和心力衰竭的影響.pdf

1、臨床研究顯示,心臟肥大不僅是心臟對(duì)各種刺激的代償反應(yīng),而且是心臟病發(fā)病和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,是心力衰竭,心源性猝死的最常見原因,許多心血管疾病如高血壓、瓣膜病、心肌梗死和肥厚型心肌病等均伴有心臟肥大,同時(shí)許多內(nèi)在的和外在的刺激如內(nèi)分泌失調(diào)、缺血、神經(jīng)體液因子和細(xì)胞因子等都可以誘導(dǎo)心臟肥大,其特征是心臟肥厚,心肌細(xì)胞排列紊亂和間質(zhì)纖維化?，F(xiàn)在認(rèn)為心肌長期負(fù)荷過度是引起心臟肥大的主要原因,其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,血管緊張素Ⅱ的升高,心肌肥大肽的

2、產(chǎn)生,膠原改建的直接作用以及前后負(fù)荷介導(dǎo)的機(jī)械牽拉、熱休克蛋白的調(diào)控保護(hù)等,都是心臟肥大必然的和必要的發(fā)病機(jī)制[1～4],其中機(jī)械負(fù)荷是一個(gè)很重要的激發(fā)因素。一般的觀點(diǎn)認(rèn)為心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞,出生后不久即失去了增殖的能力,因此,當(dāng)心臟處于血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷壓力下時(shí),心肌細(xì)胞數(shù)量并沒有增加而體積增大,產(chǎn)生適應(yīng)性心肌肥厚增加收縮力,減小室壁張力以對(duì)抗增加的負(fù)荷,但隨著負(fù)荷的持續(xù)增加,出現(xiàn)失代償,即非心肌細(xì)胞數(shù)量增加并且產(chǎn)生許多細(xì)胞外基質(zhì)

3、蛋白如膠原和纖維,從而發(fā)生左心室重構(gòu),最終導(dǎo)致心臟的功能失調(diào)。長期的心臟肥大可導(dǎo)致許多心臟疾病如擴(kuò)張型心肌病、充血性心衰、心肌梗死、心律失常和心源性猝死。目前臨床上對(duì)于心臟肥大的治療仍缺乏有效的手段。雖然心內(nèi)科治療方法多樣,藥物繁多,但是總體療效并不滿意,主要是因?yàn)閷?duì)于心臟肥大的病理生理過程及其產(chǎn)生的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)不充分,因此,確定心臟肥大的分子機(jī)制非常重要,將有助于我們找到預(yù)防和治療的有效措施。
　　 粒細(xì)胞集落刺激因子(gra

4、nulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)是一個(gè)25kDa的糖蛋白,由于其能有效地誘導(dǎo)動(dòng)員骨髓干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞,間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞入血,臨床上最初用來治療中性粒細(xì)胞減少和在骨髓移植方案中,近來許多動(dòng)物研究證實(shí)其在心肌梗死等缺血引起的心力衰竭的預(yù)防保護(hù)中具有重要作用,能改善心功能,縮小梗死面積,其主要機(jī)制就是G-CSF能誘導(dǎo)梗死心臟的血管新生,甚至有小部分動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞在心臟微環(huán)境下轉(zhuǎn)化為心肌

5、細(xì)胞的報(bào)道,雖然對(duì)此觀點(diǎn)學(xué)術(shù)界還有爭(zhēng)論,但G-CSF動(dòng)員骨髓中干細(xì)胞至外周血使其“募集”到心臟梗死區(qū),促進(jìn)血管新生,改善心肌重構(gòu)的作用是明確的。最近研究發(fā)現(xiàn)G-CSF對(duì)心肌細(xì)胞具有直接保護(hù)作用,其主要機(jī)制是G-CSF通過直接作用于心肌細(xì)胞上的受體Jak/Stat系統(tǒng),抑制心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其生存,這也是在急性心肌梗死中G-CSF改善心功能的重要機(jī)制,這提示我們G-CSF可能對(duì)非缺血性心臟病如壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭也有保護(hù)作用

6、。這方面的研究很少,曾有類似報(bào)道G-CSF可以減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌病的Fas蛋白表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,保持心肌超微結(jié)構(gòu)的完整,最終改善心功能,其治療機(jī)制與心肌梗死模型一致,G-CSF能逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的失活,且G-CSF的這種有益作用在心肌病已經(jīng)形成后仍然有效。因此本實(shí)驗(yàn)旨在研究G-CSF對(duì)壓力超負(fù)荷引起的非缺血性心室重構(gòu)及心力衰竭的影響,探究其可能的作用機(jī)制,為臨床治療高血壓性心肌肥厚和心力衰竭提供新的思

7、路。
　　 目前國內(nèi)國外均趨于利用小鼠壓力超負(fù)荷模型來研究從心臟肥大逐漸向心力衰竭轉(zhuǎn)變的病理生理和分子機(jī)制,故首先探討如何在短時(shí)間內(nèi)建立壓力超負(fù)荷模型,應(yīng)用此類模型揭示心臟肥大的內(nèi)在分子機(jī)制,是具有重要意義的研究課題。
　　 第一部分
　　 壓力超負(fù)荷后心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠的生物學(xué)特性觀察
　　 目的:探索在短時(shí)間內(nèi)建立小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因后壓力超負(fù)荷模型,為深入研究心臟肥大的分子機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。方法:雄

8、性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為升主動(dòng)脈縮窄組(手術(shù)組)和同期假手術(shù)組(對(duì)照組),手術(shù)組根據(jù)暫時(shí)阻斷主動(dòng)脈血流5s、10s、30s同時(shí)左心腔內(nèi)分別注射Ad-LacZ或PBS后又分為LacZ組和PBS組,觀察術(shù)后4周不同時(shí)間小鼠體重、頸動(dòng)脈血壓和心臟超聲等變化。HE染色和X-gal染色分別觀察心肌肥厚情況和基因轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果:手術(shù)成活率88.8％。升主動(dòng)脈縮窄小鼠的血壓較對(duì)照組明顯升高?？s窄術(shù)后2周心肌明顯肥厚,4周時(shí)出現(xiàn)失代償性心力衰竭。X

9、-gal染色顯示阻斷血流5s以上心臟有藍(lán)染,但10s、30s之間無明顯區(qū)別。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)單有效,重復(fù)性好,可在短時(shí)間內(nèi)建立小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因和壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型,為心臟肥大的深入研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。左心室心腔直接注射轉(zhuǎn)染Ad-LacZ基因同時(shí)阻斷升主動(dòng)脈血流10s以上可以使目的基因有較好的表達(dá)。
　　 第二部分
　　 G-CSF對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭的影響
　　 目的:探討粒細(xì)胞集落刺激因子

10、(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制。方法:10～12周齡雄性C57BL/6小鼠86只,隨機(jī)分成7組并給予相應(yīng)干預(yù):PBS組小鼠(PBS組)、替米沙坦組小鼠(ST組)、G-CSF(A)組小鼠(GA組)、G-CSF(B)組小鼠(GB組)、G-CSF+替米沙坦組小鼠(GT組)、替米沙坦+G-CSF組小鼠(TG組)和假手術(shù)組小鼠(Sha

11、m組)。小鼠經(jīng)縮窄升主動(dòng)脈后,在不同時(shí)間皮下注射G-CSF或(和)替米沙坦,每周做心臟超聲檢測(cè)心臟功能和形態(tài)變化,分別于第1周、2周和4周末測(cè)量右側(cè)頸動(dòng)脈壓后取材,用HE染色、Masson三色染色觀察心臟形態(tài)變化,用Westernblotting檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和RT-PCR檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induciblefactorl,HIF-1)、

12、p53mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)在0d-14d,縮窄升主動(dòng)脈的小鼠心室壁厚度值逐漸升高達(dá)高峰,14d-28dPBS組厚度逐漸降低,同時(shí)伴有左室射血分?jǐn)?shù)的下降,而給予G-CSF皮下注射的小鼠未見有降低,也未見有射血分?jǐn)?shù)的下降;(2)同PBS組比較,VEGF蛋白、HIF-1mRNA表達(dá)在給予G-CSF皮下注射的小鼠顯著升高,而p53mRNA表達(dá)、心臟纖維化程度和死亡率在給予G-CSF組顯著降低。結(jié)論:G-CSF通過調(diào)控血管新生,改善了

13、壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭,其中調(diào)控HIF-1的表達(dá)可能起著重要的作用。
　　 結(jié)論
　　 1.利用左心室心腔內(nèi)直接注射后縮窄升主動(dòng)脈的方法可在短時(shí)間內(nèi)建立小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因和壓力超負(fù)荷模型,左心室心腔直接注射轉(zhuǎn)染Ad-LacZ基因同時(shí)阻斷升主動(dòng)脈血流10s以上可以使目的基因有較好的表達(dá);
　　 2.G-CSF通過調(diào)控血管新生,改善了壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭,其中調(diào)控HIF-1和p53的表達(dá)可能起

14、著重要作用。
　　 潛在價(jià)值和創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.首次利用腺病毒載體成功將目的基因轉(zhuǎn)染入小鼠心肌細(xì)胞建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型;
　　 2.在轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)上證實(shí)經(jīng)升主動(dòng)脈縮窄可在短時(shí)間內(nèi)建立心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠壓力超負(fù)荷模型,并應(yīng)用此模型成功模擬了壓力超負(fù)荷下從心臟肥大逐漸向心力衰竭轉(zhuǎn)變的病理生理過程,為揭示心臟肥大的內(nèi)在分子機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　 3.發(fā)現(xiàn)G-CSF可能通過調(diào)控HIF-1和p53的表達(dá),促進(jìn)心