mPDL1-hIg對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的效應(yīng).pdf

1、背景
　　 程序性死亡受體-1(programmed death 1, PD-1)是CD28家族中的成員?；罨腡細胞與B細胞表達PD-1。PD-1通過與程序性死亡受體配體1(programmed death ligand 1, PDL1)或程序性死亡受體配體2(programmed death ligand 2, PDL2)結(jié)合，傳遞抑制性協(xié)同刺激信號。T細胞與B細胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。作為一個重要的T細胞與B細胞

2、活化的負性調(diào)節(jié)分子，PD-1可能是一個治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的靶點。
　　 mPDL1-hIg是由小鼠PDL1胞外段與人IgGFc組成的融合蛋白，具有小鼠PDL1的生物活性。由于mPDL1-hIg含有人IgGFc，因而mPDL1-hIg能比較容易地檢測及純化。而且，mPDL1-hIg中人IgGFc理論上可延長mPDL1-hIg中小鼠PDL1胞外段的半衰期，有利于mPDL1-hIg中小

3、鼠PDL1胞外段在體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)。
　　 II膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（Collagen II-induced arthritis, CIA）是廣泛用來研究人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的實驗關(guān)節(jié)炎模型。
　　 目的
　　 在成功構(gòu)建mPDL1-hIg基因真核表達載體、進而獲得穩(wěn)定表達mPDL1-hIg的CHO細胞株，從而獲得mPDL1-hIg的基礎(chǔ)上，探討mPDL1-hIg對CIA的效應(yīng)，為探索治療RA提供新思維、新方法以及實驗依

4、據(jù)。
　　 方法
　　 ①活化的正常小鼠去紅細胞的脾細胞與mPDL1-hIg相互作用后，再與熒光素標記的抗人IgG二抗作用，流式細胞術(shù)檢測活化的正常小鼠去紅細胞的脾細胞與mPDL1-hIg的結(jié)合率。
　　 ②小牛II型膠原2次免疫的小鼠去紅細胞的脾細胞經(jīng)過CFSE染色后，再用變性小牛II型膠原刺激。流式細胞術(shù)檢測mPDL1-hIg對變性小牛II型膠原刺激的細胞增殖的影響，ELISA法檢測mPDL1-hIg對變性小

5、牛II型膠原刺激的細胞表達IL-17與IL-23的影響。
　　 ③小牛II型膠原2次免疫小鼠誘導(dǎo)CIA，并將小牛II型膠原免疫小鼠隨機分成2組：實驗組與對照組，實驗組小鼠用mPDL1-hIg治療，對照組小鼠用人IgG治療。從第0天起，每天觀測小鼠（第二次免疫的時間確定為第0天）。
　　 ④在第九天，取mPDL1-hIg治療的CIA小鼠和人IgG治療的CIA小鼠的血清， ELISA法檢測血清中IL-17與IL-23的表達。

6、
　　 ⑤在第九天，取血清后，用頸椎脫位法處死m(xù)PDL1-hIg治療的CIA小鼠和人IgG治療的CIA小鼠，然后迅速剪取腳爪組織，快速置入10％福爾馬林溶液，固定腳爪組織；接著將固定好的腳爪組織移入10％ EDTA溶液中脫鈣；脫鈣完成后沖洗、脫水、包埋成蠟塊，最后切片及HE染色。
　　 ⑥mPDL1-hIg治療的和人IgG治療的CIA小鼠的去紅細胞的脾細胞經(jīng)過CFSE染色后，再用變性小牛II型膠原刺激，流式細胞術(shù)檢測mP

7、DL1-hIg治療對變性小牛II型膠原刺激的CIA小鼠去紅細胞的脾細胞增殖的影響，ELISA法檢測mPDL1-hIg治療對變性小牛II型膠原刺激的CIA小鼠去紅細胞的脾細胞表達IL-17與IL-23的影響。
　　 ⑦全部數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)間差異顯著性檢測采用U檢驗。用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，p＜0.05有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 ①流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：mPDL1-hIg可

8、與活化的正常小鼠去紅細胞的脾細胞結(jié)合；在我們實驗條件下，結(jié)合率約為43.62％。
　　 ②流式細胞術(shù)證明：mPDL1-hIg可抑制變性小牛II型膠原刺激的來源于小牛II型膠原免疫小鼠的去紅細胞的脾細胞增殖；ELISA檢測結(jié)果表明：mPDL1-hIg可抑制變性小牛II型膠原刺激的來源于小牛II型膠原免疫小鼠的去紅細胞的脾細胞表達IL-17與IL-23。
　　 ③mPDL1-hIg治療可顯著降低小牛II型膠原免疫小鼠的的臨床

9、評分，盡管發(fā)病率沒有受到影響（實驗組與對照組的發(fā)病率都是6/7(86％)）。來源于mPDL1-hIg治療小鼠和人IgG治療小鼠的腳爪組織切片HE染色后顯示，mPDL1-hIg治療可減輕關(guān)節(jié)病理改變。這些結(jié)果證明，mPDL1-hIg治療可抑制CIA加重，提示：PD-1-PDL途徑涉及CIA的病理機制。
　　 ④ELISA檢測結(jié)果表明：mPDL1-hIg治療可下調(diào)CIA小鼠血清中IL-17與IL-23的表達。
　　 ⑤流式細

10、胞術(shù)證明：mPDL1-hIg治療能夠抑制變性小牛II型膠原刺激的CIA小鼠去紅細胞的脾細胞增殖。ELISA檢測結(jié)果表明：mPDL1-hIg治療能夠抑制變性小牛II型膠原刺激的CIA小鼠去紅細胞的脾細胞表達IL-17與IL-23。這些結(jié)果提示：mPDL1-hIg治療通過抑制細胞增殖及IL-17與IL-23的表達而改善CIA。
　　 結(jié)論
　　 mPDL1-hIg可顯著改善CIA，表現(xiàn)在降低臨床評分、減輕關(guān)節(jié)病理改變及下調(diào)血