人抑胃肽基因的克隆和重組表達(dá)及其藥理作用研究.pdf

1、GIP是同一胃腸激素共同使用兩個(gè)名稱即抑胃肽(GastricInhibitoryPeptide，GIP)和葡萄糖依賴促胰島素多肽(Glucose-dependentInsulinotropicPolypeptide，GIP)的共同稱謂。GIP是由42個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽激素，屬于血管活性腸肽(VIP)/胰高血糖素/胰泌素家族。1970年由Brown等首先從豬小腸提取物中分離純化。人抑胃肽(humanGIP，hGIP)基因定位于17號(hào)染

2、色體上，GIP主要存在于十二指腸和空腸粘膜隱窩的K細(xì)胞；在大鼠，其胃、腸、脂肪、腎上腺皮質(zhì)、垂體、腦、心、肺及大血管內(nèi)皮中都有GIP受體基因(GIPreceptorgene，GIPR)mRNA表達(dá)。自1970年發(fā)現(xiàn)GIP以來，其研究多集中于結(jié)構(gòu)方面，而功能方面的研究涉足不多，一般認(rèn)為，GIP在調(diào)節(jié)血糖、抑制胃酸分泌以及肥胖癥的發(fā)病中可能有重要作用，其理論研究和醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值前景誘人，目前對(duì)GIP的研究已經(jīng)成為一個(gè)較為活躍的研究領(lǐng)域。

3、 用生化分離技術(shù)直接從動(dòng)物體內(nèi)提純GIP，因其含量極微，從而使得GIP的獲得具有來源有限、成本高企等不足；而依靠人工合成GIP，其造價(jià)也相當(dāng)昂貴，因而GIP的產(chǎn)量也受到極大限制。本文利用分子生物學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、藥理學(xué)及生物信息學(xué)等研究方法，進(jìn)行了GIP基因的克隆、體外重組表達(dá)、重組人GIP蛋白(recombinanthumanGIP，rhGIP)的純化及其生理活性檢測(cè)等研究，在此基礎(chǔ)上，研究并建立高效能的表達(dá)系統(tǒng)，提高

4、分離純化效率，以期得到有生物活性的rhGIP產(chǎn)品。本論文根據(jù)已知hGIP基因及其編碼的氨基酸序列，結(jié)合表達(dá)宿主工程菌對(duì)密碼子的偏好性，進(jìn)行hGIP基因的改造和克隆，并進(jìn)行原核表達(dá)，rhGIP融合蛋白的分離純化，然后研究重組融合蛋白GIP的藥理活性。 本研究中構(gòu)建了rhGIP蛋白的融合表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-GIP，然后對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了篩選。其優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件為：工程菌生長(zhǎng)密度OD600值為0-50，IPTG濃度為0-5m

5、mol/L，誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間4h，超聲破碎及純化用PBS緩沖液。融合蛋白約占細(xì)胞總蛋白的35％，其中部分為可溶性，部分以包涵體形式存在。通過親和層析純化此融合蛋白，經(jīng)過WesternBlot檢測(cè)，該蛋白質(zhì)具有免疫活性，純化的rhGIP融合蛋白經(jīng)定量分析后，rhGIP融合蛋白濃度為3-75mg/ml。 rhGIP融合蛋白的藥理作用研究主要進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。首先是通過測(cè)定大鼠胃酸的pH值，觀察rhGIP融合蛋白對(duì)大鼠胃液

6、分泌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直接灌胃rhGIP融合蛋白能使大鼠胃液酸度下降，pH值顯著高于生理鹽水對(duì)照組(p＜0-01)，表明其有抑制胃酸分泌的作用；rhGIP融合蛋白組與標(biāo)準(zhǔn)品GIP組的作用差異不顯著。另外，使用(苯海拉明)磷酸組胺能夠使胃液的基礎(chǔ)pH值下降，接著灌注GIP或rhGIP融合蛋白，大鼠胃液pH值均顯著高于灌注生理鹽水對(duì)照組(p＜0-01)，進(jìn)一步驗(yàn)證了rhGIP融合蛋白抑制胃酸分泌的作用。其次，通過在高血糖背景下，腹腔注射

7、rhGIP融合蛋白，檢測(cè)其對(duì)大鼠血漿血糖濃度及血清中胰島素濃度的影響。結(jié)果表明，rhGIP融合蛋白組在15min后，其血糖峰值較正常對(duì)照組顯著降低(p＜0-05)；30min與單獨(dú)注射葡萄糖的模型對(duì)照組無顯著差異。rhGIP融合蛋白組的血糖變化情況與標(biāo)準(zhǔn)品GIP組無顯著差異。葡萄糖模型對(duì)照組15min時(shí)，胰島素水平達(dá)到峰值(533.19±66.2pmol/ml)，45min后降至接近基礎(chǔ)值。標(biāo)準(zhǔn)品GIP組15min和30min時(shí)，胰島素

8、水平高于模型對(duì)照組，60min內(nèi)的曲線下面積(AUC)顯著大于模型對(duì)照組(p＜0.05)。rhGIP融合蛋白在15min時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品GIP胰島素水平接近，在30、60min時(shí)，rhGIP融合蛋白組比GIP組引起的胰島素水平升高顯著(p＜0.05)，rhGIP融合蛋白組60min內(nèi)的曲線下面積(AUC)顯著大于GIP組的AUC(p＜0.05)。 再次，本文利用經(jīng)過誘導(dǎo)分化的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤菌株(PC12)作為神經(jīng)細(xì)胞模型，通過形

9、態(tài)學(xué)觀察，NO自由基檢測(cè)和MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，初步探討了rhGIP融合蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)作用及其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ誘導(dǎo)的癡呆損傷及缺氧損傷的作用。結(jié)果顯示，培養(yǎng)細(xì)胞28h后，rhGIP融合蛋白組NO水平較正常對(duì)照組低，且差異顯著(p＜0.05)。 利用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，建立阿爾茨海默病(AD)細(xì)胞模型，0.1μmol/L標(biāo)準(zhǔn)品GIP組比模型對(duì)照組的細(xì)胞存活率差異顯著(p＜0-05)；rhGIP融合蛋